檢測(cè)HBV YMDD突變生物傳感器基因芯片的制備及其初步臨床應(yīng)用.pdf

1、建立一種無(wú)需大型設(shè)備，基因芯片信號(hào)經(jīng)生物傳感器原位放大后可肉眼判讀的乙型肝炎病毒YMDD突變檢測(cè)的生物傳感器基因芯片，使之成為一種成本低、耗時(shí)短、能在基層醫(yī)院普及應(yīng)用的YMDD突變檢測(cè)基因芯片。 方法: (1)在我們生物傳感器基因芯片技術(shù)專利和前期研究的基礎(chǔ)上，應(yīng)用clustal軟件，通過(guò)對(duì)Genebank中200個(gè)以上乙型肝炎病毒的全基因組序列，進(jìn)行比對(duì)分析，找到保守序列及突變特異性序列。根據(jù)乙型肝炎病毒YMDD區(qū)特異

2、性的基因序列，設(shè)計(jì)合成檢測(cè)YMDD區(qū)rtL180M,rtM2041,rtM204V等突變位點(diǎn)的成套探針，應(yīng)用我們的專利技術(shù)，將其固定在功能化薄膜生物傳感器基片上，制備出相應(yīng)的YMDD突變檢測(cè)基因芯片。 (2)應(yīng)用人工合成的特異性YMDD寡核苷酸、經(jīng)測(cè)序證實(shí)的YMDD突變質(zhì)粒及本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)基因芯片檢測(cè)并測(cè)序確定突變類型的13份臨床血清作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)不同探針與目的片段雜交的Tm值差異，在特定離子濃度條件下進(jìn)行洗脫，最終獲得

3、特異性的突變型或野生型毒株的鑒別信號(hào)，以建立相應(yīng)的檢測(cè)方法并驗(yàn)證其特異性。 (3)通過(guò)使用梯度稀釋的含YMDD序列的單鏈寡核苷酸、YMDD質(zhì)粒及不同病毒載量的HBV血清為模板的PCR產(chǎn)物，探索本芯片系統(tǒng)檢測(cè)的敏感性。 (4)通過(guò)同一樣本的重復(fù)檢測(cè)，以驗(yàn)證本款生物傳感器基因芯片的可重復(fù)性。 (5)最后，在此基礎(chǔ)上，應(yīng)用該芯片系統(tǒng)對(duì)不同類型的臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步驗(yàn)證本芯片系統(tǒng)的臨床使用可靠性。 結(jié)果:

4、 本研究結(jié)果表明，在我們以往研究的生物傳感器基因芯片的基礎(chǔ)上，本款YMDD突變檢測(cè)生物傳感器芯片較好地實(shí)現(xiàn)了YMDD突變信號(hào)的檢測(cè)，達(dá)到了不需要任何大型設(shè)備，就可準(zhǔn)確判讀檢測(cè)結(jié)果的水平。此外，本研究還表明： (1)本實(shí)驗(yàn)的PCR擴(kuò)增體系，穩(wěn)定可靠，擴(kuò)增效率較高，其最低檢測(cè)模板病毒載量濃度為103copies/ml，具有較高的擴(kuò)增靈敏度； (2)在病毒載量濃度為103copies／ml濃度及單鏈寡核苷酸濃度為0.01

5、um的濃度下，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的可重復(fù)性的雜交信號(hào)，證明本芯片具有較高的檢測(cè)靈敏度。 (3)該生物傳感器基因芯片系統(tǒng)對(duì)人工合成的6種寡核苷酸、2種YMDD突變質(zhì)粒及本實(shí)驗(yàn)室保存的經(jīng)基因芯片檢測(cè)并測(cè)序確定突變類型的13份臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果與其測(cè)序結(jié)果完全一致，提示本芯片對(duì)相應(yīng)位點(diǎn)的檢測(cè)具有很高的特異性，重復(fù)性好。 (4)110例拉米夫定治療半年以上的臨床血清中，經(jīng)檢測(cè)，野生型80例，YIDD變異型11例，YVDD變異型1

6、6例，YIDD、YVDD混合突變型3例。50例未經(jīng)核苷類抗病毒治療的HBV DNA陽(yáng)性血清中，檢測(cè)到1例YVDD突變型。50例正常人血清未檢測(cè)到探針陽(yáng)性信號(hào)，具有較高的臨床可靠性。 本芯片集生物傳感器技術(shù)、基因芯片技術(shù)及生物素標(biāo)記技術(shù)為一體，通過(guò)生物傳感器將基因芯片檢測(cè)信號(hào)原位放大，從技術(shù)上實(shí)現(xiàn)了不需要大型設(shè)備、肉眼即可判讀，大大降低了臨床使用的成本。本款以檢測(cè)YMDD突變?yōu)橹饕康牡男酒瑹o(wú)需任何大型設(shè)備，解決了基因芯片技術(shù)在基