人乳頭瘤病毒高危型的CODEHOP檢測(cè)及-16、-18型核酸檢測(cè)質(zhì)控物的研究.pdf

1、第一部分人乳頭瘤病毒(HPV)高危型-16，-18核酸檢測(cè)質(zhì)控物的研究。 目的:研制得到能模擬真實(shí)臨床標(biāo)本的人乳頭瘤病毒(HPV)高危型16、18核酸檢測(cè)質(zhì)控物，并探討其用于臨床實(shí)驗(yàn)室HPV-16、18核酸檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的有效性。 方法:本實(shí)驗(yàn)分為兩大部分，第一部分中，通過(guò)PCR方法克隆出HPV-16臨床檢測(cè)常用的靶基因片段，利用分子克隆方法構(gòu)建含HPV-16靶基因的真核細(xì)胞載體pEGFP-C1-HPV-16質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染

2、已含HPV-18的Hela上皮細(xì)胞系，獲得含HPV-16、18核酸的上皮細(xì)胞原液，經(jīng)甲醇固定后，檢測(cè)其穩(wěn)定性和特異性。第二部分中，將測(cè)定好各項(xiàng)指標(biāo)的細(xì)胞原液適當(dāng)稀釋后，組成含陰陽(yáng)性的共12份標(biāo)本的樣本盤(pán)，發(fā)至全國(guó)各開(kāi)展臨床HPV-16，-18檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行一次全國(guó)性的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)，并對(duì)回報(bào)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。 結(jié)果:構(gòu)建了含HPV-16檢測(cè)片段的重組真核表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入宮頸上皮癌細(xì)胞系(Hela)中，得到了可模擬臨床標(biāo)本的HP

3、V-16，-18 PCR檢測(cè)的質(zhì)控物，采用深圳匹基、中山達(dá)安HPV PCR商品檢測(cè)試劑盒對(duì)樣本進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。樣本原液經(jīng)1：10、1：50、1：100、1：500稀釋后，實(shí)時(shí)熒光：PCR檢測(cè)HPV-16的C<,T>值分別為29.10、31.19、32.15和32.73，HPV-18的C<,T>值分別為30.32、32.13、32.22和35.55。質(zhì)控物在4℃下可穩(wěn)定40天以上，盲郵至新疆烏魯木齊、內(nèi)蒙古呼和浩特和廈門(mén)的樣本，返回后

4、檢測(cè)無(wú)明顯變化。44個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室對(duì)濃度大于10<'4>拷貝/ml的樣本的檢測(cè)符合率平均為95.13％，對(duì)低于10<'3>拷貝/ml的樣本的檢測(cè)符合率為57.3％。對(duì)陰性樣本符合率為98.3％。 結(jié)論:成功地得到了可模擬臨床標(biāo)本的HPV-16，18核酸檢測(cè)質(zhì)控物，可有效地用于臨床實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)評(píng)，質(zhì)評(píng)結(jié)果表明，臨床實(shí)驗(yàn)室仍有待于提高HPV-16，18檢測(cè)的靈敏度。 第二部分人乳頭瘤病毒(HPV)高危型CODEHOP檢測(cè)方法的

5、研究。 目的:利用一致-簡(jiǎn)并雜交寡核菅酸引物(consensus-degenerate hybridoligonucleotide primer，CODEHOP)這種新的引物設(shè)計(jì)方法檢測(cè)HPV高危型，并探討其用于臨床實(shí)驗(yàn)室HPV高危型核酸檢測(cè)有效性。 方法：通過(guò)GenBank databases或EMBL databases得到HPV高危型各亞型L1基因序列和低危型各亞型將不同的L1基因序列輸入Block Maker程序

6、獲得氨基保守的氨基酸模塊(block)，將這些保守的模塊進(jìn)行對(duì)比，挑選出E區(qū)間和J區(qū)間這兩個(gè)與低危型不同區(qū)間設(shè)計(jì)引物，將這些保守的模塊輸入到blocks網(wǎng)站上的CODEHOP程序上，獲得一系列引物，根據(jù)簡(jiǎn)并度，退火溫度，等一系列條件，挑選出合適的雜交引物對(duì)，將得到的雜交引物進(jìn)行篩選通過(guò)嘗試性PCR擴(kuò)增優(yōu)化反應(yīng)條件，利用篩選的引物和優(yōu)化過(guò)的反應(yīng)條件對(duì)已知的質(zhì)粒樣本進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)其特異性和靈敏性，并對(duì)陽(yáng)性的臨床樣本進(jìn)行擴(kuò)增，檢驗(yàn)其在臨床上的

7、實(shí)用性。 結(jié)果:合成針對(duì)HPV高危型的CODEHOP雜交引物，利用該引物對(duì)己知的質(zhì)粒樣本進(jìn)行擴(kuò)增，得到理想條帶。檢測(cè)出HPV-45，-51，-16，-18等多種高危型。由于時(shí)間限制，只對(duì)59份未分型臨床樣本進(jìn)行了檢測(cè)，陽(yáng)性40份，陽(yáng)性率為67.8％，檢測(cè)為陰性的有19份，占32.2％。 結(jié)論:得到了檢測(cè)人乳頭瘤病毒的CODEHOP雜交引物，并對(duì)其靈敏度和特異性進(jìn)行了檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果良好，由于該引物針對(duì)的是HPV的高危型，因