microRNA與人乳頭瘤病毒16型的作用靶點(diǎn)研究.pdf

1、前言:
　　人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)，為一組微小無(wú)包膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒。現(xiàn)有的基礎(chǔ)研究和流行病學(xué)調(diào)查證據(jù)表明，HPV感染尤其是高危型HPV感染幾乎是所有宮頸癌發(fā)生的必要條件。宮頸癌是婦女常見(jiàn)的生殖道惡性腫瘤之一，全球每年約有49萬(wàn)新診斷宮頸癌病例，死于宮頸癌的患者超過(guò)27萬(wàn)。目前發(fā)現(xiàn)的HPV基因型別已經(jīng)超過(guò)了200種，根據(jù)致瘤能力的高低，可以分為高危型、潛在高危型和低危型3類(lèi)。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期

2、大規(guī)模的研究積累及大量臨床流行病學(xué)調(diào)查，超過(guò)99％的宮頸癌樣本中包含HPV DNA，其中HPV16型在乳頭瘤病毒中致病性最強(qiáng)且與腫瘤發(fā)病關(guān)系最密切，為最主要的感染型別，與宮頸鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。
　　微小RNA(microRNA，miRNA)是一類(lèi)長(zhǎng)約19～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA，是真核生物基因調(diào)控的重要組成成分，廣泛存在于從植物、線蟲(chóng)到人類(lèi)的細(xì)胞中。通過(guò)轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)而參與調(diào)控一系列的生命活動(dòng)，包括細(xì)胞的發(fā)

3、育、增殖及凋亡，脂肪代謝，激素分泌。近年的研究證據(jù)顯示miRNAs參與了惡性腫瘤的發(fā)生，在多種腫瘤組縱中發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)異常，腫瘤細(xì)胞與正常組織細(xì)胞miRNA表達(dá)譜具有明顯差異。對(duì)基因組中腫瘤相關(guān)基因區(qū)域序列分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，有52.5％的miRNA基因位于腫瘤相關(guān)的基因組區(qū)域或脆性位點(diǎn)附近，提示了miRNA在人類(lèi)腫瘤形成機(jī)制中起重要作用。有學(xué)者認(rèn)為在腫瘤組織中異常表達(dá)的miRNA可能存在類(lèi)似癌基因或抑癌基因的作用。這些miRNA通過(guò)正向或

4、負(fù)向調(diào)控腫瘤抑制基因、癌基因或控制細(xì)胞周期進(jìn)程、分化或凋亡的基因，在腫瘤血管生成、腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移等多種生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用。
　　近年的大規(guī)模研究中發(fā)現(xiàn)，miRNA在其表達(dá)譜異常的乳腺痛、肺癌、胃癌、肝癌、前列腺癌、胰腺痛、結(jié)腸癌等多種惡性腫瘤中起重要作用。目前研究亦發(fā)現(xiàn)宮頸癌中存在miRNA表達(dá)譜異常，值得注意的是存在miRNA表達(dá)異常的多為高危型HPV陽(yáng)性宮頸癌組織或細(xì)胞株。而在HPV陽(yáng)性宮頸癌

5、細(xì)胞株中對(duì)表達(dá)量異常的miRNA進(jìn)行上調(diào)或下調(diào)，會(huì)影響細(xì)胞株的增殖、凋亡以及癌蛋白的表達(dá)。進(jìn)行序列分析后發(fā)現(xiàn)于HPV整合位點(diǎn)附近出現(xiàn)miRNA基因的概率遠(yuǎn)高于非整合位點(diǎn)區(qū)域，以HPV16更為常見(jiàn)。
　　隨著對(duì)miRNA研究的深入，miRNA在病毒感染過(guò)程中的作用正逐漸被人們認(rèn)識(shí)，其表達(dá)異常與病毒感染的密切關(guān)系引起了人們的注意，miRNA在病毒感染性惡性疾病中的機(jī)制研究也不斷開(kāi)展。其中，在HCV和HIV等慢性病毒感染中， miRNA

6、與病毒編碼區(qū)或非編碼區(qū)互相結(jié)合引起病毒增殖及有助于受感染細(xì)胞長(zhǎng)期持續(xù)表達(dá)的重要作用已得到證實(shí);而在HBV陽(yáng)性乙肝中高表達(dá)的miRNA也被證實(shí)可調(diào)節(jié)乙肝病毒自身的基因表達(dá)，參與病毒的致病，影響肝硬化和肝癌的發(fā)生;另外，一些致病性DNA病毒如皰疹病毒、多瘤病毒、腺病毒等在被感染細(xì)胞中可自身編碼miRNA參與相關(guān)疾病的發(fā)生。
　　由此我們猜測(cè)，是否存在與高危型HPV16直接作用的miRNA，通過(guò)與HPV16上相應(yīng)靶點(diǎn)的結(jié)合，調(diào)控宮頸癌細(xì)

7、胞的增殖、凋亡，從而影響宮頸痛的發(fā)生。但目前尚無(wú)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)miRNA與HPV存在直接靶向作用。
　　在前期實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用近年來(lái)研究miRNA較常用的生物信息學(xué)技術(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)，從數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得HPV16型標(biāo)準(zhǔn)全基因組序列以及已知的人類(lèi)內(nèi)源性miRNA序列數(shù)據(jù)，運(yùn)用MiRanda、TargetScan、RNAhybrid等軟件進(jìn)行靶點(diǎn)作用預(yù)測(cè)，重點(diǎn)關(guān)注在預(yù)測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的最有價(jià)值的潛在作用靶點(diǎn)區(qū)域即HPV16的可變剪切(Alternat

8、ive splicing)位點(diǎn)區(qū)域。預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，hsa-miR-576-5p、hsa-miR-875-5p、hsa-miR-3144-3p、hsa-miR-199a四條miRNA可與HPV16的E6可變剪切區(qū)結(jié)合。
　　本課題主要通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)對(duì)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行篩選和驗(yàn)證，利用熒光素酶報(bào)告基因分析系統(tǒng)檢驗(yàn)上述四條miRNA與其相應(yīng)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)是否結(jié)合。將驗(yàn)證結(jié)果陽(yáng)性的miRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞系SiHa細(xì)胞，進(jìn)行

9、后續(xù)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)SiHa細(xì)胞凋亡、增殖及癌基因表達(dá)的影響，研究與HPV16作用的miRNA對(duì)HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞的增殖凋亡及癌基因表達(dá)的作用，對(duì)其參與HPV病毒致病的可能機(jī)制進(jìn)行初探。
　　第一部分 miRNA載體質(zhì)粒及靶序列熒光素酶報(bào)告基因載體的構(gòu)建
　　目的:構(gòu)建miRNA載體質(zhì)粒及靶序列熒光素酶報(bào)告基因載體。
　　方法:選取表達(dá)miRNA較穩(wěn)定、較高效的pSilencer4.1-CMV質(zhì)粒進(jìn)行miRN

10、A表達(dá)載體的構(gòu)建;選取近年來(lái)探索miRNA及其靶點(diǎn)結(jié)合研究中較新的psi-CHECK-2熒光素酶雙報(bào)告基因質(zhì)粒進(jìn)行miRNA靶點(diǎn)序列載體的構(gòu)建。通過(guò)PCR擴(kuò)增目的片段、重組DNA、轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞、培養(yǎng)轉(zhuǎn)化成功菌株，最后提取重組后的質(zhì)粒DNA并進(jìn)行測(cè)序鑒定。
　　結(jié)果:測(cè)序后的結(jié)果顯示，hsa-miR-576-5p、hsa-miR-875-5p、hsa-miR-3144-3p、hsa-miR-199a均成功重組進(jìn) pSilencer

11、4.1-CMV質(zhì)粒 DNA，得PSILENCER4.1-miR3144-CMV、 PSILENCER4.1-miR576-CMVPSILENCER4.1-miR875-CMV及PSILENCER4.1-miR199a-CMV;其位于HPV16上的相應(yīng)結(jié)合靶點(diǎn)均成功重組進(jìn)psi-CHECK-2熒光素酶雙報(bào)告基因質(zhì)粒DNA，得PSICHECK-2-HPV16-1、 PSICHECK-2-HPV16-2、 PSICHECK-2-HPV16-3

12、、PSICHECK-2-HPV16-4、PSICHECK-2-HPV16-5及PSICHECK-2-HPV16-6。
　　小結(jié):成功構(gòu)建了miRNA載體質(zhì)粒及靶序列熒光素酶報(bào)告基因載體。
　　第二部分雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)miRNA與其預(yù)測(cè)靶點(diǎn)結(jié)合情況
　　目的:檢驗(yàn)生物信息學(xué)預(yù)測(cè)所得四條miRNA與其相應(yīng)預(yù)測(cè)靶點(diǎn)是否結(jié)合。
　　方法:將miRNA載體質(zhì)粒即PSILENCER4.1-miRNA-CMV與靶序列

13、熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒即PSICHECK-2-HPV16-X共轉(zhuǎn)染進(jìn)HPV陰性宮頸癌細(xì)胞株C-33A，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒E1910檢測(cè)進(jìn)行雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染24hr后的細(xì)胞中內(nèi)參報(bào)告基因（螢火蟲(chóng)報(bào)告基因）熒光素酶表達(dá)量F1及主報(bào)告基因（海腎報(bào)告基因）熒光素酶表達(dá)量F2，其F2/F1比值即所得熒光素酶活性。
　　結(jié)果:PSILENCER4.1-miR199a-CMV及PSILENCER4.1-miR576-CMV與其相應(yīng)靶基因

14、熒光素酶質(zhì)粒PSICHECK-2-HPV16-5、PSICHECK-2-HPV16-6及PSICHECK-2-HPV16-2、PSICHECK-2-HPV16-3共轉(zhuǎn)染C-33A細(xì)胞后，熒光素酶活性與對(duì)照組比較無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05); PSILENCER4.1-miR875-CMV與其相應(yīng)靶基因熒光素酶質(zhì)粒 PSICHECK-2-HPV16-4、PSILENCER4.1-miR3144-CMV與其相應(yīng)靶基因熒光素酶質(zhì)粒PSIC

15、HECK-2-HPV16-1共轉(zhuǎn)染C-33A細(xì)胞后，熒光素酶活性與對(duì)照組比較明顯減弱，數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。
　　小結(jié):在生物信息學(xué)預(yù)測(cè)出的四條miRNA中，miR-875與其靶點(diǎn)HPV16-4結(jié)合;miR-3144與其靶點(diǎn)HPV16-1結(jié)合。
　　第三部分 miR-875及miR-3144對(duì)SiHa細(xì)胞調(diào)亡、增殖及癌基因表達(dá)的影響
　　目的:研究上調(diào)miR-875與miR-3144是否會(huì)影響HPV16

16、陽(yáng)性細(xì)胞株SiHa細(xì)胞的凋亡、增殖及癌基因表達(dá)。
　　方法:于體外培養(yǎng)HPV16陽(yáng)性宮頸癌細(xì)胞株SiHa細(xì)胞，將miR-875與miR-3144載體質(zhì)粒即PSILENCER4.1-miR875-CMV與PSILENCER4.1-miR3144-CMV轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24hr后觀察細(xì)胞形態(tài)改變，通過(guò)AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，采用Hoechst凋亡細(xì)胞染色法觀察SiHa細(xì)胞凋亡情況，使用Ro

17、che xCELLigence RTCA DP細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞增殖情況并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。提取轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞總RNA，采用半定量RT-PCR檢測(cè)E6 mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:與對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PSILENCER4.1-miR875-CMV的miR-875實(shí)驗(yàn)組及轉(zhuǎn)染PSILENCER4.1-miR3144-CMV的miR-3144實(shí)驗(yàn)組在AnnexinⅤ-FITC/PI雙染法流式細(xì)胞儀凋亡細(xì)胞率檢測(cè)中，細(xì)胞凋亡

18、率均顯著增高(P＜0.05);在Hoechst凋亡細(xì)胞染色法中，熒光陽(yáng)性率均顯著增高(P＜0.001)。使用 Roche xCELLigence RTCA DP細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞增殖后檢測(cè)Cell Index，結(jié)果提示與對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染PSILENCER4.1-miR875-CMV的miR-875實(shí)驗(yàn)組及轉(zhuǎn)染PSILENCER4.1-miR3144-CMV的miR-3144實(shí)驗(yàn)組Cell Index顯著降低(P＜0.05);

19、繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線明顯可見(jiàn)miR-875實(shí)驗(yàn)組及miR-3144實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖顯著抑制。半定量RT-PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比，miR-875實(shí)驗(yàn)組及miR-3144中E6 mRNA表達(dá)顯著降低(P＜0.05)。
　　小結(jié):上調(diào)miR-875與miR-3144能促進(jìn)HPV16陽(yáng)性細(xì)胞株SiHa細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖，降低E6 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.miR-875與其靶點(diǎn)HPV16-4相互結(jié)合