磁性人工抗原提呈細胞微孔反應板的研制及HBV抗原特異性T細胞的初步檢測.pdf

1、抗原特異性T細胞在機體抗感染、抗腫瘤以及自身免疫性疾病等方面發(fā)揮著至關重要的作用，其數量的多少和功能的強弱直接反映了人體特異性細胞免疫的功能狀態(tài)。所以抗原特異性T淋巴細胞的動態(tài)監(jiān)測在發(fā)病機制研究、治療方案選擇和療效觀察以及疫苗效果監(jiān)測等方面都有著重要的參考價值。近20年來，抗原特異性T細胞的檢測方法有了快速發(fā)展，從最初的Cr51釋放法、有限稀釋法和胞內細胞因子染色法發(fā)展到了現在的金標準——pMHC多聚體熒光染色及流式分析法，最具特異性和

2、準確性。但是目前臨床上依然很少對患者進行抗原特異性T細胞數量和功能的監(jiān)測，原因是pMHC多聚體價格昂貴，需要流式細胞儀等特殊儀器;針對各種HLA基因型以及各種病原體抗原、腫瘤抗原或自身抗原的商品化pMHC多聚體非常缺乏，不成系列，難以滿足對各種HLA基因型別的患者以及針對特定病原體的多種抗原表位特異性T細胞進行檢測的實際需要;不能高通量地同步進行數量和功能的分析等。所以進一步探索操作簡便、無需特殊儀器、能同步檢測抗原特異性T細胞數量和功

3、能的新方法相當重要。
　　本課題組前期以直徑為4.5μm的磁珠為載體，包被進口的H-2Kb-Ig/OVA257-264二聚體制備磁珠式人工抗原提呈細胞(aAPC-beads)，在96孔板中同步檢測OT-1鼠脾淋巴細胞群中OVA抗原特異性CD8+T細胞的數量和反應活性，建立了磁性人工抗原提呈細胞微孔反應板技術(aAPC-microplate)并進行了方法學的評價，證明了該技術在無需特殊儀器條件下的可行性。為了進一步實現該技術的試劑盒

4、化和國產化，本研究首先對pMHC多聚體制備技術進行改進，自制H-2Kb/OVA單鏈三聚體(SCT)，驗證其構象與功能;然后用該蛋白替代進口的昂貴商品制備aAPC-beads，建立aAPC-microplate，同步檢測OVA抗原特異性CD8+ T細胞的數量和功能，重新進行方法學論證;最后利用aAPC-microplate技術初步檢測慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特異性CD8+ T細胞的數量，主要的結果如下:
　　1、首次采用重

5、疊延伸PCR和同源重組技術，無需限制性內切酶和連接酶，成功構建 H-2Kb/OVA SCT重組質粒，原核表達SCT蛋白，鎳柱純化，稀釋復性折疊，繼而通過鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)將生物素化的H-2Kb/OVA SCT蛋白包被磁珠，制備成H-2Kb/OVA SCT beads。通過H-2Kb構象特異性單抗熒光染色和流式分析驗證了該SCT分子的正確空間構象;以該SCT分子為基礎構建H-2Kb/OVA四聚體，流式檢測OT-1鼠脾淋巴細胞群中OVA

6、抗原特異性CD8+T細胞的比例，與進口的H-2Kb-Ig/OVA二聚體檢測結果相似(38.09％ vs.35.32％)，提示其與特異性TCR的有效結合能力。
　　2、利用H-2Kb/OVA SCT beads，在96孔反應板中對OVA抗原特異性CD8+ T細胞進行磁性分選和計數，然后補加ConA培養(yǎng)24h，通過酶聯斑點實驗檢測OVA抗原特異性CD8+ T細胞群中分泌IFN-γ的細胞比例，作為其反應活性比。本實驗設置5個細胞接種數量

7、組，每個數量組設置3個復孔，陽性細胞數比例由復孔的平均值表示，并對5個檢測數量組的平均比例進行直線回歸方程校正。方法學的準確性分析顯示:aAPC-beads在不同細胞數量孔中與靶細胞的結合以及在磁場下的分選呈現良好的數量依賴關系和線性關系，R2值均達0.99以上;特異性分析顯示:aAPC-microplate分選后，陽性細胞群中OV抗原特異性CD8+ T細胞的比例為92.35％和86.39％（兩次實驗結果）;重復性分析顯示:在5個檢測數

8、量組之間，陽性細胞比例的平均分析內CV值為6.44％和4.01％;對同一份OT-1鼠脾淋巴細胞群進行三次重復實驗時，分析間CV值為3.22％，符合生物制品鑒定標準;與經典的pMHC多聚體流式分析法相比:兩種方法對5只OT-1鼠的檢測結果經配對t檢驗無統(tǒng)計學差異，p=0.2397，回歸分析顯示兩種檢測方法的吻合度有統(tǒng)計學意義，兩組結果有顯著相關性，相關方程為Y=2.229+0.815X，相關系數r=0.983，P＜0.01。反應活性檢測結

9、果顯示:2只OT-1鼠脾淋巴細胞群經aAPC-microp late分選后，OVA抗原特異性CD8+ T細胞群的反應活性比分別為43.83％和41.87％。另外，傳統(tǒng)ELISPOT檢測OT-1鼠脾淋巴細胞群經OVA抗原肽刺激后分泌IFN-γ的細胞比例分別為4.44％和4.01％，遠低于aAPC-microplate方法和經典pMHC多聚體流式分析法的檢測比例。
　　3、利用課題組前期自制的HLA-A*0201/HBc18-27、A

10、*0201/HBe183-191、A*0203/HBc18-27、A*0203/HBe183-191和A*0206/HBc18-27五種單鏈三聚體蛋白，包被磁珠制成五種HLA-A2/HBV beads，利用aAPC-microplate方法對慢性乙肝患者PBMC中HBV抗原特異性CD8+ T細胞進行數量檢測。初步結果有:運用流式分析和PCR-SBB方法對20余名慢性乙肝患者進行HLA-A2基因分型，得5例HLA-A2陽性患者。進口HLA

11、-A2/HBV二聚體熒光染色和流式分析顯示:HBc18-27和HBe183-191表位特異性CD8+T細胞比例分別為0.15％、0.08％、0.25％、0.08％和0.28％; aAPC-microplate檢測的相應比例為0.10％、0.11％、0.28％、0.10％和0.23％。配對t檢驗顯示兩組結果無統(tǒng)計學差異，p=0.9454，相關方程為Y=0.028+0.811X，相關系數r=0.893，P＜0.01。
　　本研究首先利

12、用新技術方案自制了H-2Kb/OVA單鏈三聚體蛋白，具有正確構象與功能;然后用其替代昂貴的進口商品建立aAPC-microplate方法，同步檢測OT-1鼠中OVA抗原特異性T細胞數量和功能，完成了方法學論證，提示了技術的可行性;最后利用aAPC-microp late技術初步檢測慢性乙型肝炎患者外周血中HBV抗原特異性CD8+T細胞的數量，結果與經典的進口HLA-A2/HBV多聚體流式分析法無統(tǒng)計學差異。本研究為下一步制備臨床試劑盒奠