NOD2協(xié)同TLR3介導(dǎo)LSEC活化HBV抗原特異性T細(xì)胞應(yīng)答.pdf

1、目的:
　　1、探索天然免疫刺激劑NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激能否打破肝竇內(nèi)皮細(xì)胞(LSEC）免疫耐受狀態(tài)。
　　2、研究LSEC在NOD2-TLR3介導(dǎo)的抗HBV免疫應(yīng)答中的作用機制。
　　方法:
　　1、尾靜脈高壓水注射(hydrodynamic injection,HI) pAAV/HBV1.2質(zhì)粒進入C57BL/6小鼠體內(nèi)，建立慢性HBV復(fù)制小鼠模型。
　　2、HI方式將pSM2/HBV1.3質(zhì)粒

2、入C57BL/6小鼠體內(nèi)，建立急性HBV復(fù)制小鼠模型，抗CD8免疫磁珠分離的方法分離脾細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞。
　　3、抗CD-90.1磁珠免疫方法分離BALB/C小鼠nave T細(xì)胞。
　　4、膠原酶灌注和抗 CD146免疫磁珠分離的方法分離 C57BL/6小鼠的 na?ve LSEC。
　　5、流式細(xì)胞術(shù)檢測 NOD2、TLR3配體單獨或聯(lián)合刺激 LSEC誘導(dǎo)的 BALB/C小鼠nave T細(xì)胞及急性HBV復(fù)制小鼠C

3、D8+T細(xì)胞的增殖及細(xì)胞因子(IL-2、IFN-γ）的分泌。
　　6、NOD2、TLR3配體單獨或聯(lián)合刺激 LSEC20h后，加入HBsAg、HBcAg肽刺激20h，PBS洗滌抗原，再加入HBV抗原特異性T細(xì)胞共孵育，5天后收集T細(xì)胞，將T細(xì)胞用HI方式導(dǎo)入小鼠肝內(nèi)，HI后第1、4、10、20、30、40、50天采血，分離血清，定量ECLIA檢測血清中HBsAg、HBeAg，定量Real time-PCR檢測血清中HBV DNA。

4、
　　7、用 NOD2、TLR3配體單獨或聯(lián)合刺激 LSEC1h、6h、20h，1h后收集細(xì)胞Phosflow檢測 NF-kBp65、MAPKp38磷酸化水平；6小時后，收集 LSEC，抽提總 mRNA，Real time RT-PCR方法檢測 LSEC內(nèi) IL-6、IL-2、TNF-α、IL-10、TGF-β、IFN-β、IFN-γ、ISG15、CCL2、CCL3、CCL4、 CCL5、CCL7、CCL8、CXCL2、CXCL9

5、、CXCL10、CXCL11、CXCL12 mRNA水平；20小時后，收集 LSEC及細(xì)胞上清，流式細(xì)胞術(shù)檢測 LSEC表面分子：MHCⅡ、CD40、CD80、CD86、PD-L1、CD54、CD106。微量樣本多指標(biāo)流式蛋白定量檢測(CBA(cytometric bead array））細(xì)胞上清中細(xì)胞因子(IL-6、TNF-α）。
　　8、用 Graphpad軟件作圖，SPSS18.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　結(jié)果:

6、r>　　1、 NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激LSEC后并未誘導(dǎo)同種異型性 T增殖及分泌 IL-2、IFN-γ。
　　2、NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激LSEC后并未誘導(dǎo)HBV抗原特異性T細(xì)胞的增殖，但可增強HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞分泌IL-2及IFN-γ。
　　3、NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激LSEC介導(dǎo)小鼠體內(nèi)抗HBV效應(yīng)。
　　4、NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激未明顯增強LSEC內(nèi) NF-kB p56和 M

7、APK p38蛋白的磷酸化水平。
　　5、NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激上調(diào) LSEC內(nèi)ISG15、IL-2、IL-6 mRNA表達水平及TNF-α、IL-6蛋白水平。
　　6、NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激上調(diào)LSEC內(nèi)趨化因子CCL5、CCL8、CXCL9、CXCL10 mRNA表達水平。
　　7、NOD2-TLR3配體協(xié)同刺激上調(diào)LSEC表面共刺激分子CD86表達水平。
　　結(jié)論:
　　1、NOD2-

8、TLR3配體協(xié)同刺激LSEC后，可介導(dǎo)LSEC由免疫耐受狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖呒せ顮顟B(tài)。
　　2、LSEC在被 NOD2-TLR3聯(lián)合激活后，雖不能誘導(dǎo)增強 HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞及同種異型性T細(xì)胞的增殖，但可增強HBV抗原特異性CD8+T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的能力。
　　3、NOD2-TLR3配體聯(lián)合刺激LSEC可誘導(dǎo)HBV抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)小鼠體內(nèi)抗HBV效應(yīng)。
　　本研究的創(chuàng)新點
　　1本次實驗顯示NOD2-

9、TLR3配體協(xié)同刺激可打破LSEC的免疫耐受狀態(tài)。
　　2初步闡明了NOD2-TLR3配體刺激激活LSEC的免疫狀態(tài)的可能機制及LSEC介導(dǎo)的 HBV抗原特異性 T細(xì)胞應(yīng)答情況。
　　本研究的意義:
　　NOD2-TLR3協(xié)同刺激可誘導(dǎo)肝內(nèi)主要抗原提呈細(xì)胞LSEC由免疫抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)為免疫激活狀態(tài)，進一步通過處于激活狀態(tài)的LSEC來誘導(dǎo)增強抗HBV病毒T細(xì)胞免疫應(yīng)答，為探索NOD2-TLR3配體作為肝內(nèi)免疫調(diào)節(jié)劑及抗HBV