HDAC1特異性抑制Runx2介導(dǎo)的OPN的轉(zhuǎn)錄活性.pdf

1、Runx2是成骨細(xì)胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一。Runx2在誘導(dǎo)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化過(guò)程中需要依賴染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化和輔助因子的參與來(lái)調(diào)控Runx2與DNA的結(jié)合和Runx2的轉(zhuǎn)錄活性的改變。例如，抑制一種組蛋白去乙酰化酶HDAC3的活性可以顯著增強(qiáng)骨鈣蛋白基因表達(dá)、加速礦化。
　　在前人關(guān)于HDACs與Runx2的相互作用的研究成果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了HDAC1對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN的基因表達(dá)調(diào)控的影響。首先，通過(guò)熒光雙報(bào)告

2、檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HDAC家族成員HDAC1，3，4，5，6，7，8，10，Sirt2以及HAT家族成員P300，GCN5，CBP對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有HDAC1和HDAC3對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性有明顯抑制作用;加入HDAC抑制劑TSA后，不僅這種抑制作用消失，反而加強(qiáng)了Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性，而且顯著地抑制了HDAC1對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的抑制作用。為了分辨核小體結(jié)構(gòu)是

3、否參與HDAC1的這種抑制作用，把OPN啟動(dòng)子連在能產(chǎn)生核小體結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒載體上，并同HDAC1、Runx2轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。結(jié)果表明產(chǎn)生核小體的載體與不產(chǎn)生核小體的載體相比，HDAC1抑制Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的作用趨勢(shì)是基本相同的，而且TSA的作用效果也是基本相同的。這說(shuō)明HDAC1對(duì)Runx2介導(dǎo)的OPN啟動(dòng)子活性的影響與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)沒(méi)有關(guān)系。
　　接下來(lái)，用免疫熒光(IF）和免疫共沉淀(Co-IP)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了HDAC1與

4、Runx2共定位于細(xì)胞核中，猜測(cè)二者可能在同一復(fù)合物中。進(jìn)一步用CHIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HDAC1和Runx2都能結(jié)合到OPN的啟動(dòng)子上。通過(guò)將HDAC1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到過(guò)表達(dá)Runx2的細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn)，HDAC1顯著抑制了Runx2誘導(dǎo)的OPN mRNA水平，但有趣的是，HDAC1對(duì)ALP mRNA水平?jīng)]有影響。在HDAC1的酶活性被TSA抑制后，Runx2誘導(dǎo)的OPN mRNA水平明顯上升，但同時(shí)Runx2誘導(dǎo)的ALP mRNA水平不變。這些結(jié)果

5、說(shuō)明HDAC1抑制Runx2誘導(dǎo)的OPN mRNA水平的作用和HDAC1抑制Runx2激活OPN啟動(dòng)子活性的作用是一致的，并且這種作用具有一定的特異性。
　　免疫印跡結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的第6天后，細(xì)胞中OPN的mRNA水平明顯提高，與此同時(shí)HDAC1蛋白水平減弱。不僅如此，還同時(shí)分析了多種不同細(xì)胞系的HDAC1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)隨著分化程度的不斷深入，其HDAC1蛋白水平也呈逐步減弱的趨勢(shì)。以上結(jié)果表明，在Runx2上調(diào)OP

6、N mRNA的水平甚至在Runx2誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化的過(guò)程中，HDAC1可能起到一種抑制性的屏障作用，當(dāng)Runx2通過(guò)了這個(gè)屏障后，HDAC1就不會(huì)再對(duì)OPN的表達(dá)起到明顯抑制作用，從而促進(jìn)Runx2的調(diào)控作用。另外，還發(fā)現(xiàn)HDAC1對(duì)Runx2的蛋白水平?jīng)]有影響，而Runx2的蛋白水平卻隨著分化而明顯增加，因此猜測(cè)在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中，可能存在HDAC1以外的某種表觀遺傳調(diào)控機(jī)制調(diào)控Runx2的蛋白質(zhì)水平，從而影響成骨細(xì)胞分化。研究初步