HDAC1介導(dǎo)的Smad7去乙?；揎棇Ψ卫w維化病變的影響及機(jī)制研究.pdf

1、背景：肺纖維化（pulmonary fibrosis,PF）的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，發(fā)病機(jī)制未充分闡明，缺乏有效的治療措施。TGF-β1/Smads(Transforming growth factor-β1/Smads)信號通路在肺纖維化發(fā)病中有著十分重要的作用。該通路激活后催化其效應(yīng)因子Smad2、Smad3發(fā)生磷酸化活化，進(jìn)而激活通路下游的相關(guān)纖維化靶基因轉(zhuǎn)錄，發(fā)揮致纖維化效應(yīng)；Smad7是TGF-β1/Smads信號通路的負(fù)調(diào)控

2、因子，具有阻遏Smad2、Smad3的磷酸化，從而抑制纖維化的重要作用。研究表明，在很多纖維化病變中，Smad7的蛋白水平明顯下降，致使其對TGF-β1/Smads通路的抑制作用減弱，促進(jìn)了纖維化的發(fā)生發(fā)展,然而與此同時，Smad7 mRNA水平往往是升高的，說明其基因轉(zhuǎn)錄未受抑制，蛋白質(zhì)生成并未減少，提示Smad7蛋白水平下降的原因可能是其蛋白降解增多所致。目前對于肺纖維化中Smad7蛋白降解增多的原因及機(jī)制，尚不甚清楚，因此探索并闡

3、明Smad7蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制，對于有效抑制肺纖維化發(fā)展具有極為重要的意義。Smad7蛋白降解的重要原因之一可能是由E3泛素連接酶Arkadia等催化其發(fā)生泛素化修飾，進(jìn)而被蛋白酶體識別而發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，Smad7的泛素化修飾位點位于多肽鏈N端第64，70位賴氨酸殘基上，而該位點也能夠結(jié)合乙?；l(fā)生乙?；揎?，提示Smad7的乙?；揎椇头核鼗揎椏赡艽嬖诟偁幮躁P(guān)系，推測處于乙?；癄顟B(tài)的Smad7蛋白能夠避免被泛素化修飾而降解，從而增

4、強(qiáng)Smad7蛋白的穩(wěn)定性并發(fā)揮其生物學(xué)作用。但是在肺纖維化疾病中，Smad7蛋白水平是否受這兩種修飾的調(diào)控，具體機(jī)制如何，并不清楚。蛋白質(zhì)的乙?；腿ヒ阴；且粋€動態(tài)的可逆過程，Smad7去乙酰化反應(yīng)主要由組蛋白去乙?；?(Histone deacetylase1,HDAC1)催化發(fā)生。然而，在肺纖維化疾病中，Smad7乙?；脚cHDAC1活性之間的關(guān)系如何，以及抑制HDAC1的活性，是否能夠提高Smad7的乙?；?，從而增強(qiáng)Sm

5、ad7蛋白穩(wěn)定性，進(jìn)而干預(yù)纖維化進(jìn)程，迄今尚未見報道，有必要對此進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步闡明Smad7蛋白穩(wěn)定性的調(diào)控機(jī)制，并為肺纖維化防治尋找到新的治療靶點。
　　目的：觀察肺纖維化病變中HDAC1、Smad7及相關(guān)纖維化指標(biāo)的表達(dá)變化，探討抑制HDAC1的活性是否能夠影響Smad7乙酰化、泛素化水平、并增強(qiáng)Smad7的蛋白穩(wěn)定性，以及由此對TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的調(diào)控和對肺纖維化病變的影響；探索肺纖維化中Smad7乙

6、?；揎椗c其蛋白穩(wěn)定性的關(guān)系、HDAC1影響Smad7蛋白表達(dá)水平的相關(guān)機(jī)制；從而闡明在肺纖維化發(fā)病中，HDAC1對調(diào)控Smad7蛋白穩(wěn)定性的重要作用，為有效治療肺纖維化提供理論和實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.組蛋白去乙?；敢种苿Ψ卫w維化中纖維化指標(biāo)的影響：
　?。?）體內(nèi)實驗：成年雄性SD大鼠，隨機(jī)分為Saline組、PQ組、PQ+SAHA組。PQ組、PQ+SAHA組，采用百草枯(Paraquat，PQ)一次性

7、腹腔注射(PQ15 mg/kg)染毒建立大鼠肺纖維化模型。PQ+SAHA組大鼠于染毒次日(d1)起給予SAHA(15mg/kg)-環(huán)糊精水溶液灌胃，1次/日，至d28；PQ組大鼠同期給予同濃度環(huán)糊精水溶液等量灌胃，1次/日，至d28；同時設(shè)鼠齡匹配的Saline組，PQ組、PQ+SAHA組大鼠染毒時給予生理鹽水等量腹腔注射，次日起給予同濃度環(huán)糊精水溶液等量灌胃，1次/日，至d28。于d28處死大鼠，留取肺臟組織用作后續(xù)檢測。通過HE、M

8、asson染色光鏡下觀察肺形態(tài)學(xué)改變；免疫組織化學(xué)染色檢測α-SMA和Collagen I(Col-I)蛋白表達(dá)；羥脯氨酸含量測定評價肺纖維化程度；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real time fluorescent quantitative-PCR，qRT-PCR)檢測Col1a1(Col-I)的mRNA表達(dá)；Western blot檢測α-SMA、E-cadherin(E-cad)、Col-I的蛋白水平。
　?。?）體外實驗：

9、正常人肺成纖維細(xì)胞株HFL1的表型鑒定及SAHA濃度的篩選：通過細(xì)胞免疫熒光(Immunofluorescence,IF)染色檢測HFL1的間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白（波形蛋白，Vimentin）的表達(dá)，并排除其他相關(guān)平滑肌細(xì)胞可能，即不表達(dá)α-SMA；MTT法篩選出恰當(dāng)?shù)腟AHA處理濃度。細(xì)胞隨機(jī)分為control組（TGF-β1－/SAHA－）、SAHA對照組（TGF-β1－/SAHA＋）、模型組（TGF-β1＋/SAHA－）、SAHA干預(yù)

10、組（TGF-β1＋/SAHA＋）。用TGF-β1（5ng/ml）刺激HFL1，SAHA（5μM）干預(yù)，處理48h。qRT-PCR檢測COL1A1(Col-I)的mRNA表達(dá)，IF檢測Col-I的蛋白表達(dá)，Western blot檢測各組細(xì)胞中α-SMA、Col-I的蛋白表達(dá)水平。
　　2.組蛋白去乙?；敢种苿Ψ卫w維化中Smad7表達(dá)及TGF-β1/Smads通路的影響：
　?。?）體內(nèi)實驗：上述各組大鼠肺組織，IF染色檢

11、測Smad7蛋白表達(dá)，qRT-PCR檢測Smad7的mRNA表達(dá)，Western blot檢測Smad7、TGF-β1、Smad3、p-Smad3蛋白水平；
　?。?）體外實驗：上述各組細(xì)胞蛋白及RNA，qRT-PCR檢測Smad7的mRNA表達(dá)，Western blot檢測Smad7、Smad3、p-Smad3蛋白水平。
　　3.組蛋白去乙酰化酶抑制劑對肺纖維化中Smad7乙?；头核鼗降挠绊懀?br>　　（1）體內(nèi)實

12、驗：上述各組大鼠肺組織，Western blot檢測HDAC1、Arkadia蛋白水平，qRT-PCR檢測Rnf111(Arkadia)的mRNA表達(dá)；
　?。?）體外實驗：比色法檢測模型組細(xì)胞24h、48h、72h HDAC1的活性變化，再檢測各組細(xì)胞48h HDAC1的活性變化；qRT-PCR檢測Smad7、RNF111(Arkadia)的mRNA表達(dá)；Western blot檢測各組細(xì)胞中HDAC1、Arkadia的蛋白水平

13、；免疫沉淀/免疫印跡（IP/IB）方法檢測各組細(xì)胞中Smad7乙?；?、泛素化水平；IF檢測Smad7、HDAC1的細(xì)胞內(nèi)定位，免疫共沉淀/蛋白印跡（Co-IP/IB）驗證兩者之間的相互作用。
　　4.敲低HDAC1表達(dá)對Smad7乙?；?、蛋白穩(wěn)定性及肺纖維化中成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響：采用HDAC1-shRNA的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染HFL1細(xì)胞，敲低HFL1中HDAC1 mRNA的表達(dá)，并給予TGF-β1刺激促進(jìn)肺成

14、纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。篩選出轉(zhuǎn)染效果最好的質(zhì)粒shRNA序列及恰當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒轉(zhuǎn)染劑量后，進(jìn)行轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分組：Blank+T組（空白對照組，不加任何轉(zhuǎn)染試劑及質(zhì)粒）、Scramble+T組（陰性質(zhì)粒對照組，轉(zhuǎn)染HDAC1-shRNA陰性質(zhì)粒）、Mock+T組（轉(zhuǎn)染試劑對照組，轉(zhuǎn)染時只加同等劑量轉(zhuǎn)染試劑，不加入質(zhì)粒）及HDAC1-sh+T組（HDAC1敲低組，轉(zhuǎn)染篩選出的最佳質(zhì)粒）。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染6h后換為含2％FBS+TGF-β1(5ng

15、/ml)的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取細(xì)胞RNA和蛋白。qRT-PCR檢測Smad7、COL1A1的mRNA表達(dá)，Western blot及IP/IB檢測Smad7、Col-I蛋白水平和Smad7的乙?；⒎核鼗?。
　　結(jié)果：
　　1.組蛋白去乙酰化酶抑制劑能抑制肺纖維化相關(guān)纖維化指標(biāo)的表達(dá)：
　?。?）PQ組大鼠肺組織形態(tài)學(xué)改變（肺臟體積縮小、顏色較白、質(zhì)硬,表面見纖維結(jié)節(jié)樣改變，凹凸不平，并可見陳舊出血

16、點；HE染色見肺泡結(jié)構(gòu)破壞，肺泡腔融合、塌陷，肺泡間隔增厚，肺間質(zhì)內(nèi)大量炎性細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增生，Masson染色見大量膠原纖維沉積）和肺組織羥脯氨酸含量測定表明大鼠肺纖維化模型復(fù)制成功，使用SAHA（PQ+SAHA組大鼠）能在一定程度上減輕肺形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞，并顯著降低肺組織羥脯氨酸的含量；在肺纖維化動物中，大鼠肺組織α-SMA、Col-I蛋白水平上升而E-cad蛋白水平下降，Col-I mRNA表達(dá)增加；加予SAHA處理，大鼠肺組

17、織α-SMA、Col-I蛋白水平下降而E-cad蛋白水平上升，Col-I mRNA表達(dá)減少。
　?。?）在體外實驗中，TGF-β1刺激HFL1細(xì)胞后，α-SMA、Col-I蛋白水平上升，Col-I mRNA表達(dá)增多；加予SAHA處理，α-SMA、Col-I蛋白水平降低，Col-I mRNA表達(dá)減少。
　　2.組蛋白去乙?；敢种苿┠苌险{(diào)Smad7蛋白水平，阻遏TGF-β1/Smads通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)：
　　（1）肺纖維化動物

18、中，大鼠肺組織Smad7蛋白水平降低、TGF-β1、p-Smad3蛋白水平升高，Smad7 mRNA表達(dá)增多；加予SAHA處理，大鼠肺組織Smad7蛋白水平上升、TGF-β1蛋白水平無明顯變化、p-Smad3蛋白水平下降，Smad7 mRNA表達(dá)進(jìn)一步增多。
　　（2）在體外實驗中，TGF-β1刺激HFL1細(xì)胞后，Smad7蛋白水平降低、p-Smad3蛋白水平升高，Smad7 mRNA表達(dá)增多；加予SAHA處理，細(xì)胞的Smad7蛋

19、白水平上升、p-Smad3蛋白水平下降，Smad7 mRNA表達(dá)進(jìn)一步增多。
　　3.組蛋白去乙?；敢种苿┥险{(diào)Smad7乙?；?、降低Smad7泛素化水平：
　?。?）與Saline組大鼠比較，PQ組大鼠肺組織HDAC1蛋白水平升高、Arkadia的mRNA和蛋白水平均升高；加予SAHA處理，大鼠肺組織HDAC1蛋白水平下降、Arkadia mRNA和蛋白水平均進(jìn)一步升高。
　?。?）TGF-β1刺激HFL1細(xì)胞后

20、，HDAC1的活性和蛋白水平升高、Arkadia的mRNA和蛋白水平升高、Smad7乙?；浇档汀mad7泛素化水平升高；加予SAHA處理，HDAC1的活性和蛋白水平降低、Arkadia的mRNA和蛋白水平進(jìn)一步升高、Smad7乙?；缴仙?、Smad7泛素化水平降低。
　　4.敲低HDAC1表達(dá)能上調(diào)Smad7乙酰化水平、降低Smad7泛素化水平、提高Smad7蛋白水平，抑制肺成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化：在TGF-β1刺

21、激的體外環(huán)境中，敲低HFL1細(xì)胞的HDAC1 mRNA表達(dá)，與正常表達(dá)HDAC1 mRNA的HFL1細(xì)胞比較，HDAC1 mRNA和蛋白水平下降約70%，Smad7的乙?；缴仙?、泛素化水平下降、蛋白水平升高，Smad7 mRNA表達(dá)增多，Col-I mRNA和蛋白水平均降低。
　　結(jié)論：
　　1.在肺纖維化組織細(xì)胞中，HDAC1蛋白表達(dá)增多、活性增強(qiáng)，與此同時，Smad7蛋白水平顯著降低，并因此促進(jìn)了TGF-β1/Sma

22、ds信號通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，使其發(fā)揮重要的致纖維化作用；
　　2.組蛋白去乙?；敢种苿㏒AHA能夠降低纖維化肺組織和細(xì)胞中HDAC1的蛋白水平和活性，提高細(xì)胞內(nèi)Smad7乙?；?、降低其泛素化水平，使得Smad7的蛋白水平增高，抑制了TGF-β1/Smads通路的致纖維化效應(yīng)；
　　3. HDAC1具有降低肺纖維化組織中Smad7蛋白水平的重要作用。敲低細(xì)胞中 HDAC1的表達(dá)，能夠提高Smad7的乙酰化水平，抑制其泛素化修飾，