自噬小體激活人抗原特異性T細(xì)胞作用研究.pdf

1、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cytotoxicity T lymphocyte， CTL)在機(jī)體清除腫瘤細(xì)胞以及入侵病原體過(guò)程中發(fā)揮重要作用。近年來(lái)，如何有效激活機(jī)體抗原特異性CD8+T細(xì)胞一直是腫瘤及感染性疾病治療性疫苗發(fā)展的重要方向。交叉提呈指抗原提呈細(xì)胞攝取，處理，并通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ(major histocompatibility complexⅠ， MHCⅠ)類分子提呈外源性抗原（如腫瘤細(xì)胞抗原）給CD8+T細(xì)胞識(shí)別的過(guò)程。

2、抗原交叉提呈是誘導(dǎo)抗原特異性CD8+T細(xì)胞激活的主要通路。交叉提呈的研究主要集中于樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)如何攝取，處理，提呈抗原。關(guān)于腫瘤抗原如何形成和提供給DC研究的較少，一般認(rèn)為腫瘤抗原由腫瘤細(xì)胞被動(dòng)的釋放，而不是主動(dòng)包裝與分泌。本研究小組既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的自噬途徑通過(guò)抗原的富集，包裝和分泌而對(duì)交叉提呈起決定性作用。
　　自噬是機(jī)體用于保持穩(wěn)態(tài)的過(guò)程，其基本過(guò)程包括將細(xì)胞漿成分隔離于雙層膜中形成自噬

3、小體，隨后自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，其中的細(xì)胞成分被溶酶體中的蛋白水解酶降解并進(jìn)入再循環(huán)。胡紅明課題組發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞的自噬在腫瘤抗原交叉提呈中發(fā)揮重要作用，自噬小體可作為抗原的載體有效誘導(dǎo)交叉提呈?；谶@些發(fā)現(xiàn)，其發(fā)展了一種叫做富含短壽蛋白的自噬小體（DRips in blebs，簡(jiǎn)稱DRibbles）的新型腫瘤疫苗，主要由自噬小體組成。生理情況下，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的囊泡很少包含泛素化蛋白，但DRibbles來(lái)自于蛋白酶體抑制劑及溶

4、酶體抑制劑處理后的腫瘤細(xì)胞，包含了多種腫瘤細(xì)胞成分，包括長(zhǎng)壽蛋白、泛素化短壽蛋白及廢蛋白。DRibbles能夠在體內(nèi)外有效交叉激活抗原特異性CD8+T細(xì)胞，來(lái)源于小鼠腫瘤細(xì)胞的DRibbles能夠治療小鼠黑色素瘤、肺癌、乳腺癌及肉瘤。然而，既往DRibbles的相關(guān)研究均以小鼠為對(duì)象，DRibbles是否能有效激活人抗原特異性T細(xì)胞尚未可知。
　　針對(duì)以上研究現(xiàn)狀和問(wèn)題，本文評(píng)估了DRibbles是否可以有效激活人記憶性抗原特異性

5、CD8+及CD4+T細(xì)胞以及作用的最佳條件;分選了人外周血單個(gè)核細(xì)胞中的DC亞群，比較各DC亞群提呈DRibbles功能的差異;采用GM-CSF/IL-4及GM-CSF/IFN-α體外誘導(dǎo)單核細(xì)胞分別生成IL-4 DC及IFN-α DC，比較了這兩種體外培養(yǎng)DC提呈DRibbles,激活T細(xì)胞功能的差異。本研究將有助于闡明DRibbles的作用機(jī)制，研發(fā)基于樹(shù)突狀細(xì)胞及自噬小體的疫苗治療腫瘤或感染性疾病。研究主要分為3個(gè)部分:
　

6、　1.DRibbles誘導(dǎo)人外周血記憶性抗原特異性T細(xì)胞激活
　　目的:探討DRibbles激活人抗原特異性T細(xì)胞功能。
　　方法:用表達(dá)巨細(xì)胞病毒(cytomegalovirus， CMV) pp65蛋白或者編碼HLA-A2限制性CMV、EB病毒、流感病毒（cytomegalovirus、epstein-barr virus、influenza virus， CEF）抗原表位的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胚胎腎細(xì)胞株HEK293T或者人肺癌

7、細(xì)胞株UbiLT3，從這些能夠表達(dá)病毒抗原的細(xì)胞中提取DRibbles或細(xì)胞裂解產(chǎn)物，將其負(fù)載至人單核細(xì)胞或PBMC并與自體T細(xì)胞作用，隨后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色方法檢測(cè)人CMV pp65或者CEF抗原特異性記憶性CD8+及CD4+T細(xì)胞反應(yīng)。并且檢測(cè)細(xì)胞因子GM-CSF、IL-4、IL-12、TNF-α、IFN-α-2b、IFN-γ，toll樣受體(toll likereceptor，TLR)刺激物脂多糖（lipopolysaccharide

8、，LPS）、Poly(I∶C)、M52-CpG、R848、TLR2配體以及CD40配體對(duì)DRibbles交叉提呈的作用。
　　結(jié)果:(1)與負(fù)載陰性對(duì)照HEK293TE6E7 DRibbles的單核細(xì)胞相比負(fù)載HEK293T CEF DRibbles的單核細(xì)胞能夠激活更多的CD8+T細(xì)胞(2.40％ vs0.06％，P＜0.01)和CD4+T細(xì)胞(0.56％ vs0.03％，P＜0.05);在24例CMV血清學(xué)陽(yáng)性供者的PBMC中

9、，UbiLT3 pp65 DRibbles能夠誘導(dǎo)0.24％的CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ，陰性對(duì)照UbiLT3 GFP DRibbles刺激組僅為0.08％(P＜0.01);在UbiLT3 pp65DRibbles刺激下，能夠分泌IFN-γ的CD4+T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞百分比為0.54％，陰性對(duì)照UbiLT3 GFP DRibbles刺激下IFN-γ+CD4+T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞為0.04％，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.

10、01;(2)與不加Poly(I∶C)組相比，Poly(I∶C)組中的UbiLT3pp65 DRibbles能夠刺激更多的CD8+T分泌IFN-γ(2.99％ vs0.10％，P＜0.05);當(dāng)采用Poly(I∶C)與CD40L共同刺激PBMC時(shí)，DRibbles激活PBMC中抗原特異性CD8+T細(xì)胞并不優(yōu)于單用Poly(I∶C)組(P＞0.05); Poly(I∶C)與CD40L的加入并不影響 DRibbles誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞反應(yīng)(

11、P＞0.05); CpG和LPS能夠增強(qiáng)UbiLT3 pp65 DRibbles的交叉提呈，激活CD8+T細(xì)胞;然而R848（TLR7/8刺激物）及TLR2刺激物對(duì)增強(qiáng)DRibbles誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)沒(méi)有作用;(3) GM-CSF及IL-4的加入增加了UbiLT3 pp65 DRibbles誘導(dǎo)的抗原特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)（3.71％ vs5.22％，P＜0.01），但不增加抗原特異性CD4+T細(xì)胞反應(yīng)(2.53％ vs2.4

12、1％，P＞0.05);當(dāng)IL-4從培養(yǎng)體系中去除后，DRibbles刺激出的pp65特異性T細(xì)胞反應(yīng)沒(méi)有明顯變化;IFN-α-2b，IFN-γ，IL-1α，TNF-α不能增強(qiáng)DRibbles誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng);(4)Western blots檢測(cè)結(jié)果提示與細(xì)胞裂解產(chǎn)物相比，DRibbles中含更多的泛素化蛋白;細(xì)胞裂解產(chǎn)物與DRibbles中的CMV pp65蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯差異;DRibbles中可見(jiàn)更多148KD高分子量的pp65蛋白

13、條帶，可能是泛素化的pp65蛋白;(5)在抗原終濃度為3μg/ml、10μg/ml、25μg/ml反應(yīng)條件下，與細(xì)胞裂解產(chǎn)物相比，UbiLT3pp65 DRibbles能更有效的刺激CMVpp65特異性CD8+T細(xì)胞激活(P＜0.05);在誘導(dǎo)CD4(+)T細(xì)胞激活功能方面，DRibbles在低濃度條件下與細(xì)胞裂解產(chǎn)物類似，在高濃度條件下稍差于細(xì)胞裂解產(chǎn)物。
　　結(jié)論:包含病毒抗原（CMVpp65抗原或CEF抗原）的DRibble

14、s可作為抗原載體在體外有效誘導(dǎo)人PBMC中記憶性病毒抗原特異性CD8+及CD4+T細(xì)胞激活;聯(lián)合使用Poly(I∶C)、CD40配體及GM-CSF可增強(qiáng)DRibbles的交叉提呈。
　　2.人PBMC中各DC亞群交叉提呈DRibbles功能比較
　　目的:研究PBMC中各DC亞群交叉提呈DRibbles功能。
　　方法:采用NycoprepTM1.068分離液密度梯度離心PBMC，獲取高密度細(xì)胞及低密度細(xì)胞，隨后將低密

15、度細(xì)胞通過(guò)流式細(xì)胞儀分選獲取CD141+ DC、CD1c+DC、CD11c-CD141-細(xì)胞及單核細(xì)胞。同時(shí)，采用磁珠分選方法自PBMC中分選出CD8+及CD4+T細(xì)胞。通過(guò)細(xì)胞內(nèi)染色方法檢測(cè)上述分選獲得的4群APC提呈UbiLT3 pp65 DRibbles，激活CMVpp65抗原特異性CD8+及CD4+T細(xì)胞功能差異。
　　結(jié)果:(1) NycoprepTM1.068分離液密度梯度離心PBMC能夠富集PBMC中DC亞群于低密度

16、細(xì)胞中。與PBMC相比，低密度細(xì)胞中CD141+DC比例增加6倍，CD1c+DC比例增加4倍，CD11c-CD141-細(xì)胞比例增加約3倍;(2)隨著APC∶T比值增加，經(jīng)過(guò)NycoprepTM1.068分離液密度梯度離心PBMC獲取的高密度細(xì)胞及低密度細(xì)胞分別負(fù)載UbiLT3 pp65 DRibbles后能誘導(dǎo)更多的CD8+及CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ;與PBMC中的高密度細(xì)胞相比，低密度細(xì)胞負(fù)載UbiLT3 pp65 DRibble

17、s后能誘導(dǎo)更多的CD8+及CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ;(3)在CD141+ DC、CD1c+ DC、CD11c-CD141-細(xì)胞及單核細(xì)胞中，Poly(I∶C)刺激后，CD141+ DC能最有效交叉提呈UbiLT3 pp65 DRibbles，誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞分泌IFN-γ。
　　結(jié)論:在Poly(I∶C)作用下，CD141+ DC是CD141+ DC、CD1c+ DC、CD11c-CD141-細(xì)胞及單核細(xì)胞中能夠最有效交叉提

18、呈UbiLT3 pp65 DRibbles，激活CMVpp65抗原特異性CD8+T細(xì)胞的APC。
　　3.兩種體外培養(yǎng)的DC負(fù)載DRibbles后激活人抗原特異性T細(xì)胞活性比較
　　目的:比較IL-4 DC及IFN-α DC負(fù)載自噬小體疫苗后激活人抗原特異性T細(xì)胞的活性。
　　方法:體外培養(yǎng)人單核細(xì)胞獲取IL-4 DC及IFN-α DC;制備表達(dá)CEF蛋白的HEK293T細(xì)胞，從中提取HEK293T CEF DRibb

19、les;分別用IL-4 DC及IFN-α DC負(fù)載HEK293T CEFDRibbles后刺激自體T淋巴細(xì)胞，用細(xì)胞內(nèi)染色方法檢測(cè)分泌IFN-γ的T細(xì)胞占總T細(xì)胞的百分比;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-4 DC及IFN-α DC表型差異。
　　結(jié)果:負(fù)載HEK293T CEFDRibbles的IFN-αDC能夠誘導(dǎo)6.0％的自體CEF抗原特異性CD8+T細(xì)胞激活，而IL-4 DC只能誘導(dǎo)2.3％的抗原特異性CD8+T細(xì)胞激活，兩組比較差異有

20、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與IL-4 DC相比，負(fù)載HEK293T CEF DRibbles的IFN-α DC能夠更有效的激活自體CEF抗原特異性CD4+T細(xì)胞(2.6％ vs0.3％，P＜0.05);與IL-4 DC相比，IFN-α DC細(xì)胞體積小，顆粒復(fù)雜程度低，表達(dá)較低水平的CD14、CD11c，HLA-DR的表達(dá)水平類似。
　　結(jié)論:與IL-4 DC相比，IFN-α DC負(fù)載HEK293T CEF DRibbles后能更