抗原特異性TH17細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化的研究.pdf

1、研究背景和目的： TH17細(xì)胞即產(chǎn)生IL-17的Th細(xì)胞亞群，這一細(xì)胞亞群的發(fā)現(xiàn)源于自身免疫病機(jī)制的研究。TH1細(xì)胞功能失調(diào)引起嚴(yán)重炎癥反應(yīng)并誘導(dǎo)產(chǎn)生多種自身免疫病。但是，IFN-γ缺陷鼠或IFN-γR缺陷鼠無IFN-γ信號(hào)，仍可發(fā)生自身免疫病，甚至對自身免疫病更易感。這說明，除產(chǎn)生IFN-γ的TH1細(xì)胞外，還有另一Th細(xì)胞亞群參與誘導(dǎo)自身免疫病。這一獨(dú)特的細(xì)胞亞群即為TH17或IL-17產(chǎn)生細(xì)胞。TH17具有很強(qiáng)的促炎癥作用，

2、并與多種自身免疫病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。 TH17產(chǎn)生IL-17A(IL-17)和IL-17F、IL-22,還產(chǎn)生GM-CSF、IL-6、TNF等細(xì)胞因子。IL-17具有促炎癥作用，誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子(如IL-6、TNF)、趨化因子(如MCP-1和MIP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)，引起組織細(xì)胞浸潤和組織破壞。IL-17也參與中性粒細(xì)胞的增殖、成熟和趨化，對T細(xì)胞的活化起協(xié)同刺激作用，并能促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟。 TH17細(xì)胞亞

3、群的發(fā)現(xiàn)，彌補(bǔ)了TH1／TH2介導(dǎo)效應(yīng)機(jī)制的不足，成為全球科研工作者的研究熱點(diǎn)。本課題著眼于TH17細(xì)胞的誘導(dǎo)和分化的研究。 作為細(xì)胞分化的終端之一，TH17細(xì)胞與TH1、TH2細(xì)胞亞群之間有著復(fù)雜的相互影響，TH1或者TH2型細(xì)胞因子的存在可以抑制TH17的分化，TH17細(xì)胞也可以抑制TH1或TH2細(xì)胞分化。其他細(xì)胞因子也可以促進(jìn)TH17細(xì)胞發(fā)育和分化，但是IL-17本身卻不能直接抑制TH1或者TH2細(xì)胞發(fā)育而促進(jìn)其發(fā)育分化。

4、與TH1、TH2特異性轉(zhuǎn)錄因子不同，TH17細(xì)胞不表達(dá)T-bet、H1x或GATA-3。有人認(rèn)為TH1和TH17前體細(xì)胞發(fā)育分化存在共同的T-bet依賴性途徑，但誘導(dǎo)T-bet表達(dá)的分子(IFN-γ和STAT1等)卻可以明顯抑制TH17發(fā)育和分化。另外有認(rèn)為TH17可能與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞有關(guān)，TGF-β單獨(dú)存在時(shí)可以促進(jìn)未致敏CD4+T細(xì)胞分化為抗炎的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，而在IL-6共存時(shí)，可以促進(jìn)TH17細(xì)胞分化和發(fā)育。最近有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥性T

5、h17細(xì)胞的分化發(fā)展需要γ干擾素調(diào)節(jié)因子4(Interferon-regulatery factor 4，IRF4)的參與，而IRF4為Th2細(xì)胞分化所必須，因此有人推測，Th17與Th2有共同前體。眾說紛紜，因此對TH17細(xì)胞的研究有助于我們深入研究CD4+T細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)，進(jìn)而探討自體免疫性疾病等免疫病理學(xué)機(jī)制。目前對于TH17細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究多基于多克隆刺激的基礎(chǔ)之上。鑒于此，本課題的豐要研究內(nèi)容為：利用轉(zhuǎn)基因小鼠的抗原特異性

6、T細(xì)胞，在體外研究能夠促進(jìn)抗原特異性TH17細(xì)胞誘導(dǎo)和分化的最佳條件。 研究內(nèi)容和方法 1)取DO11.10或BALB／c小鼠的脾臟，研磨，篩網(wǎng)過濾，然后經(jīng)小鼠淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心，收取單個(gè)核淋巴細(xì)胞，用完全RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3x109/L。 2)將新鮮分離的DO11.10小鼠單個(gè)核細(xì)胞與同背景BALB／c小鼠單個(gè)核細(xì)胞懸液按1：4比例混合，在有／無OVA多肽、相應(yīng)細(xì)胞因子或抗細(xì)胞因子抗

7、體不同組合的情況下培養(yǎng)，收集初次培養(yǎng)的細(xì)胞，懸浮于新鮮RPMI 1640培養(yǎng)液中，其中加入低劑量IL-2繼續(xù)培養(yǎng)，收集休息完全的細(xì)胞，加入OVA多肽二次培養(yǎng)。 培養(yǎng)分組為： ①培養(yǎng)條件1：Medium／OVA／OVA+TGF-β／OVA+IL-6／OVA+TGF-β+IL-6 ②培養(yǎng)條件2：Medium／OVA／OVA+IL-23／OVA+TGF-β+IL-23／OVA+TGF-β+IL-6+IL-23

8、③培養(yǎng)條件3：Medium／OVA／OVA+LPS／OVA+TGF-β+IL-6+IL-23／OVA+TGF-β+IL-6+IL-23+LPS ④培養(yǎng)條件4：Medium／OVA+TGF-β+IL-6+IL-23／OVA+TGF-β+IL-6+IL-23+antilFN-γ／OVA+TGF-β+IL-6+IL-23+antiIL-4／OVA+TGF-β+IL-6+IL-23+antiIL-4+antiIFN-γ 3)收集

9、初次和二次培養(yǎng)的細(xì)胞上清，ELISA方法檢測相應(yīng)的細(xì)胞因子濃度。檢測指標(biāo)：IL-17，IFN-γ，IL-44)收集二次培養(yǎng)后的細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀，在單個(gè)細(xì)胞水平上觀察抗原特異性T細(xì)胞細(xì)胞因子的產(chǎn)生，探討不同培養(yǎng)條件對抗原特異性TH17細(xì)胞分化的影響。檢測指標(biāo)：IL-17，IFN-γ 結(jié)果 1)單純OVA抗原刺激主要誘導(dǎo)特異性TH1型反應(yīng)； 2)在TGF-β和IL-6存在的條件下，主要誘導(dǎo)TH17反應(yīng)；

10、3)當(dāng)加入IL-23之后，促進(jìn)了TH17細(xì)胞的分化。 4)阻斷了IFN-γ和IL-4之后，TH17細(xì)胞的百分率明顯增加。 5)LPS可以促進(jìn)TH1型細(xì)胞因子的產(chǎn)生，但對抗原特異性TH17細(xì)胞的分化沒有明顯的促進(jìn)作用。其詳細(xì)的機(jī)制尚有待研究。 結(jié)論 抗原特異性TH17細(xì)胞是與TH1、TH2相對獨(dú)立的細(xì)胞亞群，TGF-β和IL-6聯(lián)合作用誘導(dǎo)抗原特異性TH17的分化；IL-23的作用是促進(jìn)TGF-β和IL-6