全細(xì)胞性腫瘤抗原以不同方式負(fù)載樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)肝癌特異性T細(xì)胞反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、肝癌是一種常見的惡性腫瘤，預(yù)后非常差，許多患者在初次診斷時(shí)已經(jīng)處于進(jìn)展期或出現(xiàn)肝外轉(zhuǎn)移，只有很少一部分患者適合手術(shù)治療。隨著免疫學(xué)和腫瘤生物學(xué)的發(fā)展，免疫治療作為腫瘤治療的一種新策略?？鼓[瘤免疫的重要目的就是誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)和輔助性T(Th)淋巴細(xì)胞。而獲得腫瘤特異性CTL和Th細(xì)胞的一個(gè)重要方法就是負(fù)載各種腫瘤抗原的抗原呈遞細(xì)胞，如樹突狀細(xì)胞(dendriticcell，DC)。DC是體內(nèi)功能最強(qiáng)的職業(yè)

2、抗原提呈細(xì)胞，可攝取、加工、提呈抗原，在體內(nèi)、體外激發(fā)初次和繼發(fā)性T細(xì)胞免疫應(yīng)答。近年來(lái)，DC越來(lái)越多地被用于抗腫瘤免疫。在DC免疫治療試驗(yàn)研究中已成功地誘導(dǎo)出抗腫瘤反應(yīng)，并且在一些臨床試驗(yàn)中也表現(xiàn)出很好的效果。 目前已發(fā)現(xiàn)多種可被CD8+CTL識(shí)別的腫瘤抗原，但對(duì)于大多數(shù)腫瘤來(lái)說(shuō)，仍無(wú)有效的腫瘤相關(guān)抗原或特異性抗原。另外，由于腫瘤突變，針對(duì)單一抗原的免疫治療有時(shí)并不能發(fā)揮其應(yīng)有的作用。對(duì)于某些未知特異性抗原或相關(guān)性抗原的腫瘤，

3、為使DC能夠負(fù)載更多的抗原，利于臨床應(yīng)用，人們研究了多種抗原的制備方法，例如：射線照射后的腫瘤細(xì)胞，腫瘤裂解物，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的RNA，凋亡小體以及腫瘤來(lái)源的exosome等。這些方法，有可能通過(guò)MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ兩種途徑呈遞大量的抗原，誘導(dǎo)多價(jià)免疫反應(yīng)，并且誘導(dǎo)的特異性CTL和Th細(xì)胞有可能通過(guò)協(xié)同作用而進(jìn)一步放大免疫學(xué)效應(yīng)。 選用全細(xì)胞性抗原作為肝癌DC免疫治療的抗原負(fù)載方式，是必需的且具有一定優(yōu)勢(shì)。理論上，這種抗原負(fù)載方

4、式，包括所有已知和未知的抗原，都有被DC呈遞到細(xì)胞表面的可能，因而能夠誘導(dǎo)出范圍更大，程度更強(qiáng)的免疫反應(yīng)。這一點(diǎn)，對(duì)于肝癌這樣缺乏明確腫瘤抗原的惡性腫瘤來(lái)說(shuō)，是尤為重要的。因此本研究選擇全細(xì)胞抗原作為DC抗原負(fù)載方式，包括腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC、腫瘤細(xì)胞和DC融合以及腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC等3種方式。我們對(duì)以3種形式負(fù)載抗原的DC瘤苗體外抗腫瘤活性進(jìn)行了比較研究，并對(duì)它們體外誘導(dǎo)的T細(xì)胞反應(yīng)的異同進(jìn)行分析。 目的：本研究選擇不

5、同形式的全細(xì)胞腫瘤抗原負(fù)載DC，包括腫瘤細(xì)胞裂解物致敏DC，腫瘤細(xì)胞和DC融合，以及腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC等。對(duì)這3種抗原負(fù)載形式的DC瘤苗體外抗腫瘤活性進(jìn)行比較，分析其體外誘導(dǎo)T細(xì)胞反應(yīng)的異同，以期選擇更好的適宜臨床應(yīng)用的DC瘤苗。 方法： 1.肝癌患者DC的誘導(dǎo)及鑒定：選擇肝癌患者及正常人外周血，血細(xì)胞分離機(jī)分離富集外周血PBMC，經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液梯度離心、聚苯乙烯細(xì)胞培養(yǎng)板貼壁純化后，加入含GM-CSF和IL-4

6、的X-vivo15培養(yǎng)液聯(lián)合誘導(dǎo)DC分化，誘導(dǎo)d6加入TNF-α促進(jìn)DC成熟。分別以倒置顯微鏡、電子顯微鏡觀察DC形態(tài)變化；FCM檢測(cè)細(xì)胞表型變化；MTT法檢測(cè)DC刺激同種異體淋巴細(xì)胞增殖的能力。 2.腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒效應(yīng)：綠色熒光蛋白質(zhì)粒載體pEGFP-C3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2，Trizol法提取篩選后細(xì)胞HepG2-GFP總RNA；分離肝癌患者外周血單核細(xì)胞體外誘導(dǎo)DC，總RNA轉(zhuǎn)染DC，熒

7、光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效果，流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后DC表型變化；ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后上清中IL-12變化情況；取患者外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中非貼壁細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，L)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以含IL-2、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)；將RNA-DC以5×104/mL密度加入上述淋巴細(xì)胞中，共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨(dú)淋巴細(xì)胞組為對(duì)照)，72h后再次加入同劑量DC，孵育72h，收獲細(xì)胞分別稱為RNA-DC

8、-L、DC-L和L。以RNA-DC-L、DC-L和L作為效應(yīng)細(xì)胞，肝癌細(xì)胞株HepG2、SMMC7721及白血病細(xì)胞株K562為靶細(xì)胞，以不同效靶比(5：1、10：1、20：1)接種于96孔板，48h后MTT法測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)各腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。 3.三種全細(xì)胞性瘤苗體外細(xì)胞毒活性比較：分別以肝癌細(xì)胞株HepG2凍融抗原致敏患者DC(Lys-DC)，HepG2總RNA轉(zhuǎn)染DC(RNA-DC)，HepG2與DC融合(Fus-DC)

9、作為刺激細(xì)胞，取患者外周靜脈血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中非貼壁細(xì)胞(淋巴細(xì)胞，L)，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，以含IL-2、10％FCS的RPMI1640培養(yǎng)；將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以5×104/mL密度分別加入上述淋巴細(xì)胞中，共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨(dú)淋巴細(xì)胞組為對(duì)照)，再次加入同劑量DC，孵育72h，收獲細(xì)胞分別稱為L(zhǎng)ys-DC-L、RNA-DC-L、Fus-DC-L、DC-L和L。以Lys-DC-

10、L、RNA-DC-L、Fus-DC-L、DC-L和L作為效應(yīng)細(xì)胞，肝癌細(xì)胞株HepG2為靶細(xì)胞，以效靶比20：1接種于96孔板，48h后MTT法測(cè)定效應(yīng)細(xì)胞對(duì)各腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。 4.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞功能比較：分離CD8+T細(xì)胞，以含IL-2(400U/mL)、10％FCS的RPMI1640重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板；將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以5×104/

11、mL密度分別加入上述淋巴細(xì)胞中，共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨(dú)淋巴細(xì)胞組為對(duì)照)，72h后再次加入同劑量DC，孵育72h，收獲細(xì)胞分別稱為L(zhǎng)ys-DC-T、RNA-DC-T、Fus-DC-T、DC-T和T。收集各組細(xì)胞上清，應(yīng)用IFN-γELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)IFN-γ分泌。 5.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞功能比較：分離CD4+T細(xì)胞，以含IL-2(400U/mL)、10％FCS的RPMI1640重懸，調(diào)整細(xì)胞

12、密度為2×105/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板；將Lys-DC、RNA-DC、Fus-DC以2×104/mL密度分別加入上述淋巴細(xì)胞中，共同孵育72h(設(shè)未致敏DC組和單獨(dú)淋巴細(xì)胞組為對(duì)照)，72h后再次加入同劑量DC，孵育96h后，MTT法檢測(cè)各種瘤苗刺激自體CD4+T細(xì)胞增殖的能力。 結(jié)果： 1.肝癌患者DC鑒定：誘導(dǎo)后，患者DC顯示出典型的形態(tài)及表型特征。其中，誘導(dǎo)d8(加TNF-α活化48h)，各抗原表達(dá)量明顯升

13、高，分別為：CD83(95.94±1.78)％、CD86(96.33±2.19)％、CD80(94.19±1.89)％、HLA-DR(93.71±3.67)％，為典型DC表型；健康對(duì)照DC各抗原表達(dá)量為CD83(94.78±3.67)％、CD86(94.65±2.50)％、CD80(94.70±1.69)％、HLA-DR(93.06±3.72)％，二者間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)?；旌狭馨图?xì)胞反應(yīng)結(jié)果顯示，患者DC具有高效地刺激同種異

14、體淋巴細(xì)胞增殖的能力，其刺激指數(shù)(SI)與健康對(duì)照DC的SI無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 2.腫瘤細(xì)胞總RNA轉(zhuǎn)染DC誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒效應(yīng)：pEGFP-C3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞HepG2后可得到穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞HepG2-GFP，熒光顯微鏡下所有細(xì)胞均呈現(xiàn)綠色熒光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)綠色熒光蛋白表達(dá)99％以上；HepG2-GFP總RNA轉(zhuǎn)染的DC熒光顯微鏡下呈綠色熒光，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞比率可達(dá)50％以上，轉(zhuǎn)染后D

15、C表面分子CD80(13.2％上升至86.7％)，HLA-DR(38.9％上升至97.9％)，CD83(0.9％上升至97.1％)，CD86(31.2％上升至92.5％)表達(dá)明顯升高，上清IL-12分泌量顯著增高(61.3±8.1ng/L→287.4±29.3ng/L，P＜0.05)；RNA-DC-L對(duì)HepG2的殺傷率明顯高于對(duì)另一肝癌細(xì)胞SMMC7721和白血病細(xì)胞K562的殺傷率，對(duì)SMMC7721的殺傷率也高于對(duì)白血病細(xì)胞K56

16、2的殺傷率。 3.三種全細(xì)胞性瘤苗體外細(xì)胞毒活性比較：Lys-DC-L、Fus-DC-L、RNA-DC-L組均顯示對(duì)HepG2高效特異的殺傷活性，顯著高于DC-L組和單純L組；但Fus-DC-L、RNA-DC-L對(duì)HepG2的殺傷率明顯高于Lys-DC-L組；而Fus-DC-L、RNA-DC-L組對(duì)HepG2的殺傷率無(wú)明顯區(qū)別。 4.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞功能比較：Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC刺

17、激的CD8+T細(xì)胞組IFN-γ分泌顯著高于DC刺激的CD8+T細(xì)胞組和單純CD8+T細(xì)胞組；但Fus-DC、RNA-DC刺激組IFN-γ分泌顯著高于Lys-DC刺激組；而Fus-DC、RNA-DC刺激組IFN-γ分泌無(wú)明顯區(qū)別。 5.三種瘤苗誘導(dǎo)腫瘤特異性CD4+T細(xì)胞功能比較：Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC組刺激自體CD4+T細(xì)胞增殖功能顯著高于DC組；但Lys-DC、Fus-DC、RNA-DC刺激自體CD4+T細(xì)胞

18、增殖功能無(wú)明顯區(qū)別。 結(jié)論： 1.從肝癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞，可成功誘導(dǎo)出功能正常的樹突狀細(xì)胞，肝癌患者體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的DC，可以應(yīng)用于肝癌的免疫治療。 2.腫瘤總RNA轉(zhuǎn)染的DC以及融合瘤苗能更有效的誘導(dǎo)腫瘤特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，是更為有效的DC免疫治療方式。腫瘤總RNA轉(zhuǎn)染操作簡(jiǎn)單，應(yīng)用裸RNA轉(zhuǎn)染方法對(duì)細(xì)胞無(wú)損傷，并且在某些腫瘤細(xì)胞過(guò)少或腫瘤組織過(guò)小患者中，可以通過(guò)PCR方法擴(kuò)增得到大量RNA，因此更