HBV基因組HNF3結合位點的突變對肝細胞核因子3β抑制HBV轉錄復制作用的影響.pdf

1、肝富集轉錄因子是一類具有基因轉錄調(diào)控作用的蛋白質(zhì)分子，主要存在于肝臟，能與HBV基因組的4個啟動子結合，對HBV的基因轉錄發(fā)揮調(diào)控作用。其中，核激素受體HNF4和RXR α/PPAR α能支持HBv在非肝源細胞中轉錄與復制，為HBV前基因組RNA合成和病毒復制所必需，而肝細胞核因子3(HNF3)具有負性調(diào)節(jié)作用。 為闡明HNF3對HBV的調(diào)節(jié)機制，本研究通過構建HBV基因組多個HNF3結合位點(包括多聚酶編碼區(qū)PORF、PSl

2、p和Sp區(qū)HNF3結合位點)突變的復合突變型重組質(zhì)粒，阻斷HNF3 β與這些位點的結合，觀察是否會影響HNF3 β對HBV轉錄和復制的抑制作用，以了解HNF3β抑制HBV復制的作用位點和可能的機理，從而為尋找抗HBV治療的作用靶點提供理論依據(jù)。 方法 1．用帶有單個HNF3結合位點突變的突變型HBV重組質(zhì)粒(分別為含多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp區(qū)和Sp區(qū)HNF3結合位點單個突變的突變型重組質(zhì)粒即：pHBV4．lPpH

3、NF3mut，pHBV4．lPSlpHNF3mut和pHBV4．lSpHNF3mut)為模板，用限制性內(nèi)切酶BspEl、Bsml及Hhal酶切，獲取并純化含多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp區(qū)和Sp區(qū)HNF3結合位點突變的DNA片段，然后進行基因重組，分別構建兩個和三個HNF3結合位點復合突變的突變型重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒DNA轉化大腸桿菌內(nèi)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，用酶切和基因測序鑒定所構建HNF3結合位點復合突變的突變型HBV重組質(zhì)粒。

4、 2．轉染采用改良磷酸鈣法。為了研究肝富集轉錄因子HNF3 β、HNF4或RXR α／PPAR α在HBV轉錄和復制中的作用，我們選擇非肝源細胞株鼠成纖維細胞NIH3T3作為受體細胞。用于轉染的DNA混合液中，HBV重組質(zhì)粒劑量為15μg、肝富集轉錄因子HNF3 β、HNF4以及RXR β／PPAR α表達質(zhì)粒劑量為2μg。對照采用空載質(zhì)粒。于轉染3d，收集細胞提取細胞總RNA和HBV DNA復制中間體。 3．用Nort

5、hem吸印雜交檢測3.5kb，2.4kb，2.1kb，和0.7kb HBV RNA的轉錄水平，Southern吸印雜交檢測HBVDNA復制中間體水平。 結果 1．通過酶切，獲取含有多聚酶編碼PORF、PSlp區(qū)和Sp區(qū)三個HNF3結合位點突變的DNA片段，經(jīng)基因重組后，構建四個復合突變型質(zhì)粒。然后經(jīng)酶切和基因測序鑒定證明成功構建了四個含HNF3結合位點復合突變的突變型重組質(zhì)粒分別為：(1)含多聚酶編碼PORF、PSlp

6、區(qū)兩個HNF3結合位點復合突變【pHBV4.1(Pp+PSlp)HNF3mut】；(2)含多聚酶編碼P ORF和Sp區(qū)兩個HNF3結合位點復合突變【pHBV4.1(Pp+Sp)HNF3mut】；(3)含PSlp和Sp區(qū)兩個HNF3結合位點復合突變【pHBV4.1(PSlp+Sp)HNF3mut】(4)含多聚酶編碼PORF、PSlp和Sp區(qū)三個HNF3結合位點復合突變【pHBV4.1(Pp+PS1p+Sp)HNF3mut】的突變型重組質(zhì)粒

7、。 2．觀察在非肝源性細胞鼠成纖維細胞NIH3T3細胞中，肝富集轉錄因子介導的HBV轉錄和復制，結果顯示：HNF4或RXR α／PPARα能介導HBV在非肝源性細胞中3.5kb HBV RNA的轉錄和HBV DNA復制，HNF3 β能抑制HNF4或RXR α／PPAR α介導的HBV3.5kb RNA的轉錄和HBVDNA的復制。與未共轉染HNF3 β相比，分別下降2～3倍和3～20倍。顯示HNF3 β對HBV的負性調(diào)節(jié)作用。

8、 3．四個復合突變型重組質(zhì)粒和野生型一樣，均能在肝源性細胞中轉錄和復制，同時也能在HNF4或RXRα／PPAR α介導的NIH3T3細胞中轉錄和復制。且復制水平與野生型pHBV4.1相似。表明所構建的重組質(zhì)粒中HNF3結合位點的突變對HBV的復制水平無明顯影響。 4．觀察肝富集轉錄因子HNF3 β對三個單個HNF3結合位點突變的突變型HBV重組質(zhì)粒(分別為含多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結合位點突變)的

9、轉錄和復制的調(diào)控，結果顯示，HNF3 β仍抑制單個HNF3結合位點突變的HBV重組質(zhì)粒的轉錄和復制。表明在該區(qū)改變單個HNF3結合位點，不能阻止HNF3 β對HBV的抑制作用。 5．進一步觀察肝富集轉錄因子HNF3 β對多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結合位點復合突變的四個突變型HBV重組質(zhì)粒轉錄和復制的影響，結果顯示HNF3 β仍降低3.5kb HBV RNA的轉錄水平，抑制HBV的復制，與未共轉染HNF3 β

10、相比，分別下降2-4倍，5-25倍。表明該區(qū)的HNF3結合位點的復合突變也未能阻止HNF3 β對HBV復制的抑制作用。 結論 HBV多聚酶編碼PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結合位點，無論其中一個結合位點突變、或同時兩個、或同時三個結合位點的復合突變所構建的HBV重組質(zhì)粒，HNF3 β仍能抑制HBV的轉錄和復制。提示：多聚酶編碼區(qū)PORF、PSlp和Sp區(qū)HNF3結合位點的突變不能阻斷HNF3 β對HBV復制的抑制作