基于FAIRE技術(shù)鑒定基因組中轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合靶點(diǎn)的研究.pdf

1、目前，研究轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)的技術(shù)有:凝膠遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)、染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)技術(shù)、蛋白結(jié)合DNA微陣列芯片(PBM)、指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)、高通量測(cè)序-熒光配體互作圖譜分析(HiTS-FLIP)等等。ChIP技術(shù)是目前能夠檢測(cè)體內(nèi)TFBS的唯一方法，該技術(shù)與高通量測(cè)序技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生的ChIP-Seq技術(shù)已經(jīng)被廣泛地用于鑒定各種轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞內(nèi)的TFBS。但該技術(shù)實(shí)驗(yàn)流程非常復(fù)雜且依賴高質(zhì)量

2、抗體，因此，發(fā)展更為簡(jiǎn)單的TFBS檢測(cè)新方法很有必要。
　　本文提出一種基于甲醛輔助分離調(diào)控元件（FAIRE）技術(shù)檢測(cè)基因組中TFBS的新方法。FAIRE技術(shù)是近年來才建立的新技術(shù)，該技術(shù)用酚氯仿抽提法將DNA分為兩部分，即為水相DNA和有機(jī)相DNA，F(xiàn)AIRE實(shí)驗(yàn)只制備了水相DNA，將有機(jī)相直接舍棄，只有水相DNA顯然無法全面系統(tǒng)地揭示基因組信息。本研究除利用FAIRE技術(shù)分離水相DNA外，還用熱溫育解交聯(lián)法制各FAIRE技術(shù)中

3、舍棄的有機(jī)相DNA，利用水相和有機(jī)相DNA共同檢測(cè)體內(nèi)DNA開放區(qū)及TFBS。本文提出的新方法檢測(cè)流程非常簡(jiǎn)單，主要實(shí)驗(yàn)步驟包括:培養(yǎng)細(xì)胞、甲醛交聯(lián)固定、制備染色質(zhì)、超聲波打斷染色質(zhì)、染色質(zhì)解交聯(lián)制備INPUT DNA、FAIRE法制備水相DNA、熱溫育解交聯(lián)法制備有機(jī)相DNA，最后運(yùn)用熒光定量PCR檢測(cè)制備的INPUT DNA、水相及有機(jī)相DNA，通過相對(duì)Ct值法計(jì)算檢測(cè)片段的富集倍數(shù)，鑒定染色質(zhì)開放區(qū)及TFBS。
　　本論文針

4、對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域和NF-κB靶基因的DNA結(jié)合位點(diǎn)，論證了該新方法的可行性。首先，針對(duì)NF-κB靶基因(IL6、TNFAIP3)和持家基因(GAPDH)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)上下游基因區(qū)域，設(shè)計(jì)了一系列引物，探索了TNF-α誘導(dǎo)與否HepG2細(xì)胞中基因啟動(dòng)子區(qū)域染色質(zhì)開放狀態(tài)的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，誘導(dǎo)后，兩個(gè)靶基因相應(yīng)引物的起伏變化，要比持家基因GAPDH顯著，而且對(duì)比同一基因引物誘導(dǎo)前后，水相DNA富集倍數(shù)升高，有機(jī)相DNA富集

5、倍數(shù)降低;說明本方法可成功檢測(cè)不同細(xì)胞狀態(tài)下染色質(zhì)開放區(qū)。之后，本論文挑選了具有代表性的NF-κB靶基因(IL6、TNFRSF6、IL8、STAT5A、SLC12A7、IL7R、RELB、mir-219-1、mir-340)，對(duì)靶基因上含有NF-κBDNA結(jié)合位點(diǎn)的部位設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增TNF-α誘導(dǎo)與否HepG2細(xì)胞所制備的水相和有機(jī)相DNA，確證本方法可用于鑒定功能性TFBS。最后，利用ChIP-qPCR和RT-PCR對(duì)本方法