玉米脫水應(yīng)答元件結(jié)合因子靶基因的全基因組分析.pdf

1、脫水應(yīng)答元件結(jié)合因子(Dehydration responsive element binding factor,DREB)是植物非生物脅迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一,與許多抗逆相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)節(jié)有關(guān)。目前,已經(jīng)從多個(gè)物種中克隆了DREB基因家族成員,并驗(yàn)證其在非生物逆境脅迫下對(duì)抗逆相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)控作用。在玉米上,已克隆出DBF1、DBF2、ZmDREB1A和ZmDREB2A四個(gè)DREB基因,并驗(yàn)證除DBF2外,其余3個(gè)基因編碼蛋

2、白的非生物脅迫逆境誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子功能。但是,關(guān)于DREB的靶基因及具體的信號(hào)調(diào)控途徑,可供參考的文獻(xiàn)十分有限。迄今為止,在玉米上嚴(yán)格鑒定的DREB靶基因只有rab17。在全基因組的水平上掃描鑒定DREB的靶基因,有助于了解DREB調(diào)控抗逆相關(guān)基因表達(dá)的具體情況,解析植物逆境應(yīng)答的分子機(jī)制。
　　 通過(guò)對(duì)各種不同物種DREB蛋白的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn),DREB具有一個(gè)保守的APETALA2(AP2)結(jié)合域,特異性地識(shí)別結(jié)合抗逆相關(guān)基因

3、啟動(dòng)子序列上的順式脫水應(yīng)答元件(Dehydration responsive element,DRE)CCGAC,激活下游靶基因的表達(dá)。此外,在靶基因啟動(dòng)子序列上識(shí)別過(guò)程中,是由多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相互協(xié)同作用,結(jié)合到相應(yīng)的順式作用元件后,從而啟動(dòng)基因表達(dá)的。因此,隨著玉米基因組測(cè)序完成,我們可以根據(jù)DREB所識(shí)別的順式元件DRE及其側(cè)翼序列的保守性,并結(jié)合生物信息學(xué)方法,能夠在全基因范圍內(nèi)對(duì)DREB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的靶基因進(jìn)行掃描。
　　

4、 汪世臣(2009)將已經(jīng)確定的DREB靶基因中的DRE元件及其兩側(cè)各100 bp定義為DRE框序列(DRE frame sequence,DFS)。利用HexDiff算法計(jì)算出DFSs數(shù)據(jù)集和隨機(jī)生成的具有DRE元件的nDFSs數(shù)據(jù)集中各種不同序列hexamers出現(xiàn)的頻率比值。收集其中比值大于3.0的hexamers,作為鑒別DFS的特征,并利用這些特征構(gòu)建支持向量機(jī)(Support vector machine,SVM)訓(xùn)練模型,

5、開(kāi)發(fā)了鑒別DREB結(jié)合位點(diǎn)的支持向量機(jī)分類(lèi)器。
　　 本研究首先從斯坦福大學(xué)玉米全長(zhǎng)cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了11472條全長(zhǎng)cDNA序列,通過(guò)與玉米基因組序列數(shù)據(jù)比對(duì),我們將8416條全長(zhǎng)cDNA定位到了玉米基因組的單一位點(diǎn)上,并將其轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游1000 bp作為啟動(dòng)子區(qū)域,搜索其中DREB識(shí)別的核心序列CCGAC。運(yùn)用汪世臣開(kāi)發(fā)的DREB結(jié)合位點(diǎn)支持向量機(jī)分類(lèi)器,對(duì)核心序列兩側(cè)各100 bp共205 bp的DRE框序列進(jìn)行分

6、類(lèi)鑒別。按此方法,從玉米全基因組共預(yù)測(cè)出694個(gè)可能的DREB靶基因。然后,從各種相關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索下載,分別建立在低溫、干旱和高鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)的玉米表達(dá)序列數(shù)據(jù)庫(kù),與預(yù)測(cè)出的694個(gè)可能DREB靶基因進(jìn)行序列比對(duì)。結(jié)果表明,在694個(gè)預(yù)測(cè)的DREB靶基因中,有64、277和578個(gè)基因,分別在低溫、干旱和高鹽脅迫下上調(diào)表達(dá)。在這三種非生物逆境下上調(diào)表達(dá)的預(yù)測(cè)DREB靶基因共有596個(gè),占全部694個(gè)預(yù)測(cè)DREB靶基因的85.9％。

7、r>　　 為了驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果,我們首先根據(jù)DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A玉米上驗(yàn)證功能的3個(gè)DREB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的氨基酸序列,進(jìn)行密碼子優(yōu)化,體外化學(xué)合成DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A基因,構(gòu)建原核表達(dá)載體,誘導(dǎo)表達(dá),分離純化了DBF1、ZmDREB1A和ZmDREB2A蛋白。然后從預(yù)測(cè)的596個(gè)可能的DREB靶基因中,隨機(jī)挑取出17個(gè)基因,并根據(jù)其啟動(dòng)子中的DRE順式元件及其兩側(cè)序列合成探針。最后將這些探針