蘆筍皂苷合成相關基因分離與表達研究以及miRNA全基因組分析.pdf

1、蘆筍(Asparagus officinalis L.)俗稱石刁柏、龍須菜，系百合科天門冬屬雌雄異株宿根性多年生草本植物。蘆筍中含有游離氨基酸、維生素、微量元素硒等多種營養(yǎng)成分，以及甾體皂苷、多糖、黃酮類等藥用成分，具有極高的營養(yǎng)與藥用價值?，F代藥理學研究表明:蘆筍提取物對多種癌細胞均有抑制作用，具有降血脂、提高人體免疫功能、抗衰老等功能，其中，甾體皂苷為重要的物質基礎。但目前對于蘆筍甾體皂苷的生物合成過程研究涉及很少。本研究在分析蘆筍

2、中總皂苷含量的時空分布特征基礎上，利用RT-PCR與RACE-PCR技術分離了蘆筍皂苷合成關鍵基因的cDNA全長序列，并通過qRT-PCR技術對蘆筍不同器官及蘆筍嫩莖不同發(fā)育時期各個關鍵基因的表達量進行分析，旨在探明蘆筍皂苷合成與積累調控的分子基礎。近年來，在小分子RNA中發(fā)現了一類與調節(jié)基因表達密切相關的分子microRNA，其在多種生物學進程中具有重要的調控作用，包括生長、代謝過程以及生物或非生物脅迫反應等。本論文以雌雄蘆筍植株為材

3、料，構建了兩個sRNA文庫，利用高通量測序為研究手段，旨在從miRNA水平上分析蘆筍雌雄株之間的差異，從而找出引起蘆筍雌雄分化及維持兩者生物學特征的miRNA，為研究蘆筍的性別分化提供一定的理論基礎。而蘆筍作為植物性別分化開始的模式植物，對其的研究也為探明植物界性別分化提供一定的理論依據。
　　本研究主要研究成果:
　　(1)通過同源克隆技術及RACE技術，分離了蘆筍皂苷生物合成過程的關鍵酶法尼基焦磷酸合成酶(FPPS)、鯊

4、烯合成酶(SQS)、鯊烯環(huán)氧化酶(SE)、環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)等基因的cDNA全長序列，并對這些基因進行了生物信息學分析。AoFPPS基因的全長1405 bp，其中最大ORF為1050 bp，編碼350個氨基酸，其5'-UTR長度為54 bp，3'-UTR長度為301bp; AoSQS全長為1799 bp，包含88 bp的5'-UTR、481 bp的3'-UTR和1230的ORF，編碼409個氨基酸。AoSE基因的全長為1909 b

5、p，其中最大ORF長度為1581 bp，編碼527個氨基酸，5'-UTR長度為75 bp，3'-UTR長度為253 bp。AoCAS基因的全長為2556 bp，其中ORF長度為2283 bp，編碼760個氨基酸，克隆到的5'-UTR長度為79bp，3'-UTR長度為194bp。
　　(2)利用超聲波法提取蘆筍根、母莖、擬葉、花、果實及不同發(fā)育時期嫩莖中的總皂苷，并利用茴香醛-濃硫酸比色法測定其含量。結果表明，蘆筍不同器官中的皂苷含

6、量存在很大差異，其中擬葉中的皂苷含量最高為29.28 mg/g DW，母莖的含量最低僅為擬葉的1/3左右;處于相同生長期的蘆筍嫩莖，無論在發(fā)育的什么時期，嫩莖中部的皂苷含量最低，上部的皂苷含量最高;同一部位不同發(fā)育時期蘆筍嫩莖中的皂苷含量比較發(fā)現，各個生長期間的皂苷含量無顯著差異，這也說明隨生長時間的增加，嫩莖中干物質積累與皂苷積累可能呈一定的關系穩(wěn)定增加;而在不同發(fā)育時期的蘆筍嫩莖中，無論在發(fā)育的什么時期，嫩莖中部的皂苷含量最低，而上

7、部和下部的皂苷含量差異較小。
　　(3)利用qRT-PCR技術分析了蘆筍皂苷合成關鍵酶基因在蘆筍根、母莖、擬葉、花、果實及嫩莖不同發(fā)育時期的表達情況。結果表明，FPPS、SQS、SE、CAS基因在蘆筍不同器官及嫩莖不同發(fā)育時期的的表達量均具有較大的差異。FPPS、SQS、SE、CAS四個基因在根中的表達都很低，FPPS在母莖及花器官中的表達量較高;SQS、SE在母莖中的表達量最高;CAS基因在蘆筍花中的表達量最高。在蘆筍嫩莖中，各

8、基因在4-5cm嫩莖中的表達量相較低，9-10 cm時表達量升高，以后表達量基本穩(wěn)定;通過對蘆筍皂苷含量與各相關基因表達分析發(fā)現，蘆筍皂苷合成與基因表達之間存在一定的相關性，初步建立了蘆筍皂苷合成酶基因的表達水平與皂苷在蘆筍植株中的積累的關系。
　　(4)基于高通量測序技術，對蘆筍雌雄株進行miRNA測序，共得到153條已知的miRNA和39條蘆筍中新發(fā)現的miRNA，這些miRNA在植物的多種生物學進程中具有重要的調控作用，如m

9、iR172a調控細胞分化及種子發(fā)育，miR171家族調控細胞分裂，miR167a調控花器官形成，miR166d調控植物體的防御系統等。在這些miRNA中有53條在蘆筍雌雄株中差異表達的miRNA。根據降解組測序結果，本研究中得到的miRNA中有35條miRNA找到了靶基因序列，其中還包括一些與生殖器官分化、花器官發(fā)育、性別分化相關的miRNA，如miR159、miR167、miR172等。通過基因本體論分析（Gene Othology，