一株固氮細菌的全基因組分析與其WrbA基因功能的研究.pdf

1、本實驗室在之前的研究中，從廣西壯族自治區(qū)崇左市扶綏縣東門鎮(zhèn)采集桉樹林地土壤，并利用無氮培養(yǎng)基篩選得到了一株固氮能力較強的細菌。經過Biolog微生物鑒定系統鑒定，該細菌為產酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)，故將該菌命名為KO108。通過轉座子[mTn5gusA-pgfp21]隨機插入建立了KO108的突變體庫，在建立一種桉樹與固氮細菌互利促生體系的過程中，發(fā)現MA這一突變株能夠較穩(wěn)定地附著于桉樹根系表面。在之前的研究

2、中，已通過反向PCR確定了MA插入位點周圍的序列。
　　本研究對KO108進行全基因組測序，獲得了全基因組的序列并對其基因進行功能注釋。具體結果已上傳NCBI(accession:NZ_LQMR00000000)。
　　參考測序公司建議、實驗室已進行的biolog檢測結果和已有的文獻資料，本文比對了克雷伯氏菌屬（Klebsiella）、勞爾特氏菌屬（Raoultella）及埃希氏菌屬（Escherichia）下若干種細菌的r

3、poB，gyrA，mdh，phoE，infB，nifH基因，確認了該菌株為變棲克雷伯氏菌，并將該菌株命名為KV321。
　　通過序列比對，確認了KV321插入突變菌株MA的插入位點所在基因編碼的是色氨酸阻遏結合蛋白（the tryptophan repressor-binding protein，WrbA）。本文將KV321 WrbA蛋白序列與多個物種的類似蛋白進行了同源比對，并預測了該蛋白的分子量大小、疏水性、二三級結構等數據，

4、為以后的蛋白分析奠定了一定基礎。
　　Blast結果表明，KV321WrbA蛋白序列與大腸桿菌WrbA蛋白序列的相似度為88％，由于克雷伯氏菌WrbA蛋白報道較少，本文主要以大腸桿菌WrbA蛋白的研究成果作為參考。
　　為了驗證WrbA的功能，通過同源重組，成功構建了突變體MA的互補菌株MB。用滲透壓沖擊法提取了KV321、MA、MB的粗蛋白。KV321粗蛋白在苯醌-NADH體系中的相對酶活達到24.99μmol/min·m

5、g，而MB粗蛋白在相同體系中的相對酶活為17.16μmol/min·mg，MA粗蛋白的同一指標只有7.19μmol/min·mg。對于鐵氰化鉀-NADH體系，KV321粗蛋白的相對酶活力為1.87μmol/min·mg，MA粗蛋白為1.36μmol/min·mg，MB粗蛋白為2.41μmol/min·mg。而對于苯醌-NADPH體系，KV321粗蛋白的相對酶活力為10.75μmol/min· mg， MA粗蛋白為5.16μmol/min

6、·mg， MB粗蛋白為10.43μmol/min·mg。對于鐵氰化鉀-NADPH體系，KV321粗蛋白的相對酶活力為0.59μmol/min· mg，MA粗蛋白為0.10μmol/min· mg，MB粗蛋白為0.41μmol/min· mg。測量結果與大腸桿菌純WrbA蛋白的結果一致:WrbA蛋白對醌的催化效果比鐵氰化鉀更好，對NADH的催化效果高于NADPH。這一結果驗證了克雷伯氏菌WrbA蛋白也是一種醌類氧化酶，可能在應對外界氧化脅