楊樹脂氧合酶(LOX)家族的全基因組分析及PtLOX11基因的功能研究.pdf

1、楊樹作為重要的經濟林和生態(tài)林樹種，廣泛分布于世界各氣候帶。在楊樹的整個生活史中容易受到外界環(huán)境的脅迫，造成一定的經濟損失。目前，借助基因工程技術，定向培育抗逆新品種已經成為楊樹抗性育種的新趨勢。大量的研究報道已經證實，脂肪酸氧合酶(Lipoxygenase，LOX)途徑產生的下游產物茉莉酸類物質(JAs)和綠葉揮發(fā)性物質(GLVs)在植物的抗逆過程中起著舉足輕重的作用。作為LOX途徑中的第一個關鍵限速酶，研究LOX基因的功能可以為提高植

2、物的抗逆性提供重要的理論指導。近些年來，關于LOX基因的報道越來越多，但在楊樹中關于LOX的研究還不多見。因此本研究以生物信息學作為切入點，在全基因組層面上對楊樹LOX基因家族的成員進行鑒定與分析。以LOX基因家族為研究對象，探究四種模式植物LOX基因家族的進化歷程與復制事件。并對楊樹PtLOX11基因進行了功能研究，主要研究結果如下：
　　1.借助Phytozome數(shù)據(jù)庫，通過Blast同源搜索，共有20個LOX基因在楊樹中被鑒

3、定出來。基于進化關系的分析結果，楊樹LOX基因成員被分為兩大亞家族(9-LOX和13-LOX)?；蚪Y構及保守結構域的分析結果顯示，楊樹LOX基因序列保守程度高，且處于同一亞家族的LOX基因保守基序十分一致。染色體定位結果顯示，20個LOX基因在楊樹的9條染色體上分布是隨機的?；驈椭剖录难芯拷Y果表明串聯(lián)復制是楊樹LOX基因擴張的主要方式。
　　2.對楊樹LOX基因的電子芯片表達譜數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)LOX基因在各個組織中均有表達

4、。在病原菌侵染，外源MeJA處理和機械傷害的情況下，楊樹中的LOX表達量均有所變化，說明LOX基因參與了楊樹的逆境響應。通過實時熒光定量PCR技術，對LOX基因在外源茉莉酸甲酯誘導下基因的表達量變化進行統(tǒng)計分析，發(fā)現(xiàn)大部分楊樹LOX基因的表達量都發(fā)生了變化，有部分復制基因對的表達模式出現(xiàn)了明顯的差異。
　　3.利用現(xiàn)有的基因組數(shù)據(jù)庫信息與已發(fā)表的文獻，在葡萄和番木瓜中分別鑒定出13和11個LOX基因，結合楊樹中的20個LOX基因和

5、擬南芥中的6個LOX成員作為研究對象，分析這四個模式植物的基因組結構及進化模式。進化樹聚類結果顯示，這50個LOX基因被分為9-LOX和13-LOX兩大類。外顯子和內含子結構分析結果表明楊樹和番木瓜的LOX基因擁有較為穩(wěn)定的結構，而擬南芥和葡萄中的LOX基因在結構上發(fā)生了較大的變化。結構域和基序分析表明四種模式植物的LOX蛋白均具有Lipoxygenase和PLAT結構域。處于同一亞家族的基因成員具有相似的結構和一致的保守基序組成。

6、r>　　4.共線性分析結果表明楊樹、葡萄、擬南芥和番木瓜的染色體區(qū)域之間存在強烈且保守的微共線性關系，每個物種內除了全基因組復制事件還存在其他獨立的重復事件。進化速率分析結果顯示:除了葡萄中的VvLOX6/11外，所有旁系同源和直系同源基因對的Ka/Ks比值均小于1，這說明在四種模式植物LOX基因的進化歷程中純化選擇依然占據(jù)主導地位。
　　5.綜合進化分析，電子芯片表達譜數(shù)據(jù)和MeJA誘導下的基因變化情況，篩選了一個受茉莉酸甲酯瞬

7、時且持續(xù)誘導表達的候選基因PtLOX11，并從南林95楊中克隆得到了該基因的全長序列。PtL OX11基因ORF長度為2643bp，共編碼880個氨基酸。與毛果楊數(shù)據(jù)庫公布的序列長度一致，有4個核苷酸和1個氨基酸的不同。核苷酸序列分析表明，克隆得到的PtLOX11基因含有兩個典型的脂肪酸氧合酶結構域，分別為Lipoxygenase（位于63-286氨基酸位置）和PLAT_LH2（位于12-59氨基酸位置）。
　　6.借助大腸桿菌表

8、達系統(tǒng)獲得PtLOX11重組蛋白。酶活分析結果表明，當PtLOX11重組蛋白以亞油酸為底物反應時，最適pH值為4.5。高效液相色譜法鑒定PtLOX11重組蛋白與亞油酸的反應產物為9-HPOD，因此PtLOX11屬于9-LOX類型。亞細胞定位結果顯示，PtLOX11-GFP融合表達蛋白定位于植物的細胞質和細胞膜中。
　　綜上，本研究通過生物信息學方法對楊樹LOX基因在全基因組水平上進行鑒定及分析。采用比較基因組學方法對4種模式植物L