楊樹(shù)脂氧合酶(LOX)家族的全基因組分析及PtLOX11基因的功能研究.pdf

1、楊樹(shù)作為重要的經(jīng)濟(jì)林和生態(tài)林樹(shù)種，廣泛分布于世界各氣候帶。在楊樹(shù)的整個(gè)生活史中容易受到外界環(huán)境的脅迫，造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。目前，借助基因工程技術(shù)，定向培育抗逆新品種已經(jīng)成為楊樹(shù)抗性育種的新趨勢(shì)。大量的研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí)，脂肪酸氧合酶(Lipoxygenase，LOX)途徑產(chǎn)生的下游產(chǎn)物茉莉酸類物質(zhì)(JAs)和綠葉揮發(fā)性物質(zhì)(GLVs)在植物的抗逆過(guò)程中起著舉足輕重的作用。作為L(zhǎng)OX途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵限速酶，研究LOX基因的功能可以為提高植

2、物的抗逆性提供重要的理論指導(dǎo)。近些年來(lái)，關(guān)于LOX基因的報(bào)道越來(lái)越多，但在楊樹(shù)中關(guān)于LOX的研究還不多見(jiàn)。因此本研究以生物信息學(xué)作為切入點(diǎn)，在全基因組層面上對(duì)楊樹(shù)LOX基因家族的成員進(jìn)行鑒定與分析。以LOX基因家族為研究對(duì)象，探究四種模式植物L(fēng)OX基因家族的進(jìn)化歷程與復(fù)制事件。并對(duì)楊樹(shù)PtLOX11基因進(jìn)行了功能研究，主要研究結(jié)果如下：
　　1.借助Phytozome數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)Blast同源搜索，共有20個(gè)LOX基因在楊樹(shù)中被鑒

3、定出來(lái)。基于進(jìn)化關(guān)系的分析結(jié)果，楊樹(shù)LOX基因成員被分為兩大亞家族(9-LOX和13-LOX)。基因結(jié)構(gòu)及保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果顯示，楊樹(shù)LOX基因序列保守程度高，且處于同一亞家族的LOX基因保守基序十分一致。染色體定位結(jié)果顯示，20個(gè)LOX基因在楊樹(shù)的9條染色體上分布是隨機(jī)的。基因復(fù)制事件的研究結(jié)果表明串聯(lián)復(fù)制是楊樹(shù)LOX基因擴(kuò)張的主要方式。
　　2.對(duì)楊樹(shù)LOX基因的電子芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)LOX基因在各個(gè)組織中均有表達(dá)

4、。在病原菌侵染，外源MeJA處理和機(jī)械傷害的情況下，楊樹(shù)中的LOX表達(dá)量均有所變化，說(shuō)明LOX基因參與了楊樹(shù)的逆境響應(yīng)。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，對(duì)LOX基因在外源茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下基因的表達(dá)量變化進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)大部分楊樹(shù)LOX基因的表達(dá)量都發(fā)生了變化，有部分復(fù)制基因?qū)Φ谋磉_(dá)模式出現(xiàn)了明顯的差異。
　　3.利用現(xiàn)有的基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息與已發(fā)表的文獻(xiàn)，在葡萄和番木瓜中分別鑒定出13和11個(gè)LOX基因，結(jié)合楊樹(shù)中的20個(gè)LOX基因和

5、擬南芥中的6個(gè)LOX成員作為研究對(duì)象，分析這四個(gè)模式植物的基因組結(jié)構(gòu)及進(jìn)化模式。進(jìn)化樹(shù)聚類結(jié)果顯示，這50個(gè)LOX基因被分為9-LOX和13-LOX兩大類。外顯子和內(nèi)含子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明楊樹(shù)和番木瓜的LOX基因擁有較為穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，而擬南芥和葡萄中的LOX基因在結(jié)構(gòu)上發(fā)生了較大的變化。結(jié)構(gòu)域和基序分析表明四種模式植物的LOX蛋白均具有Lipoxygenase和PLAT結(jié)構(gòu)域。處于同一亞家族的基因成員具有相似的結(jié)構(gòu)和一致的保守基序組成。

6、r>　　4.共線性分析結(jié)果表明楊樹(shù)、葡萄、擬南芥和番木瓜的染色體區(qū)域之間存在強(qiáng)烈且保守的微共線性關(guān)系，每個(gè)物種內(nèi)除了全基因組復(fù)制事件還存在其他獨(dú)立的重復(fù)事件。進(jìn)化速率分析結(jié)果顯示:除了葡萄中的VvLOX6/11外，所有旁系同源和直系同源基因?qū)Φ腒a/Ks比值均小于1，這說(shuō)明在四種模式植物L(fēng)OX基因的進(jìn)化歷程中純化選擇依然占據(jù)主導(dǎo)地位。
　　5.綜合進(jìn)化分析，電子芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)和MeJA誘導(dǎo)下的基因變化情況，篩選了一個(gè)受茉莉酸甲酯瞬

7、時(shí)且持續(xù)誘導(dǎo)表達(dá)的候選基因PtLOX11，并從南林95楊中克隆得到了該基因的全長(zhǎng)序列。PtL OX11基因ORF長(zhǎng)度為2643bp，共編碼880個(gè)氨基酸。與毛果楊數(shù)據(jù)庫(kù)公布的序列長(zhǎng)度一致，有4個(gè)核苷酸和1個(gè)氨基酸的不同。核苷酸序列分析表明，克隆得到的PtLOX11基因含有兩個(gè)典型的脂肪酸氧合酶結(jié)構(gòu)域，分別為L(zhǎng)ipoxygenase（位于63-286氨基酸位置）和PLAT_LH2（位于12-59氨基酸位置）。
　　6.借助大腸桿菌表

8、達(dá)系統(tǒng)獲得PtLOX11重組蛋白。酶活分析結(jié)果表明，當(dāng)PtLOX11重組蛋白以亞油酸為底物反應(yīng)時(shí)，最適pH值為4.5。高效液相色譜法鑒定PtLOX11重組蛋白與亞油酸的反應(yīng)產(chǎn)物為9-HPOD，因此PtLOX11屬于9-LOX類型。亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，PtLOX11-GFP融合表達(dá)蛋白定位于植物的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中。
　　綜上，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)楊樹(shù)LOX基因在全基因組水平上進(jìn)行鑒定及分析。采用比較基因組學(xué)方法對(duì)4種模式植物L(fēng)