水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的全基因組分析及Orysa;DEL1功能的初步鑒定.pdf

1、細(xì)胞分裂是生物體中一個(gè)重要的生物學(xué)過程。真核生物細(xì)胞周期進(jìn)程調(diào)控的分子機(jī)制是高度保守的。在真核生物中已經(jīng)鑒定出細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)、細(xì)胞周期蛋白(cyclins)、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDK inhibitors,CKIs)、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastomas, Rbs)和E2F、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶亞單位(CDK subunits, CKS

2、s)等多種細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。其中,CDKs在細(xì)胞周期調(diào)控過程中起到非常重要的作用。高等植物中,在時(shí)間和空間上調(diào)控細(xì)胞分裂的進(jìn)行對(duì)植物體的形態(tài)建成是必需的。而植物激素在調(diào)控細(xì)胞周期過程中起到重要的作用。迄今對(duì)雙子葉植物細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因的研究較多,但有關(guān)單子葉植物水稻中的報(bào)道很少。水稻不僅是一種重要的模式植物,也是重要的糧食作物。因此,我們對(duì)水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因進(jìn)行了鑒定和表達(dá)分析。研究結(jié)果為闡明水稻細(xì)胞周期的分子機(jī)理及其發(fā)育調(diào)控提

3、供了有重要價(jià)值的基礎(chǔ)資料。 根據(jù)擬南芥基因組信息,利用BLAST軟件從水稻基因組中檢索到90個(gè)細(xì)胞周期相關(guān)基因的序列,其中44個(gè)基因編碼細(xì)胞周期蛋白,25個(gè)基因編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶,7個(gè)基因編碼細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,9個(gè)基因編碼E2F蛋白,2個(gè)RB蛋白基因,2個(gè)WEE激酶基因和1個(gè)CKS基因。在檢索到的90個(gè)基因中新命名的或著是對(duì)其原有的命名進(jìn)行更正的有41個(gè)基因。通過對(duì)水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹和蛋白質(zhì)

4、結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),在水稻和擬南芥中細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因之間是非常保守的。 為了研究片段重復(fù)與新的細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的產(chǎn)生之間的關(guān)系,我們繪制了水稻中CDK、E2F、CKI、CKS、Rb和Wee的不同成員在染色體上的排列分布圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在水稻的12條染色體的7條之間發(fā)生了六次片段重復(fù)事件,并且大部分的重復(fù)發(fā)生在2、3、10和12號(hào)染色體上。染色體片段的重復(fù)是產(chǎn)生新基因的基礎(chǔ),某些基因家族中不同成員的產(chǎn)生是基因組中發(fā)生片斷重復(fù)的結(jié)果?；?/p>

5、表達(dá)模式能夠?yàn)檠芯炕虻墓δ芴峁┲匾€索,我們通過半定量RT-PCR方法初步研究了水稻中細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的表達(dá)模式。結(jié)果表明水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因之間具有不同的表達(dá)模式,大部分細(xì)胞周期基因在被檢測(cè)的多數(shù)組織中均有表達(dá),而某些基因的表達(dá)具有一定的組織特異性。同一基因家族成員之間呈現(xiàn)出相似的表達(dá)模式,不同基因家族之間的表達(dá)模式差異較大?；虻谋磉_(dá)模式和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果暗示,同一家族的成員之間可能存在著功能上的冗余。 為準(zhǔn)確地了解

6、水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的表達(dá)模式,隨機(jī)選取Orysa;CycA2;1、Orysa;CycB2;2、Orysa;CycU4;4與Orysa;CDKG; 1 四個(gè)基因進(jìn)行了原位雜交分析。原位雜交結(jié)果與RT-PCR結(jié)果吻合,同時(shí)也發(fā)現(xiàn)水稻中細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的表達(dá)在時(shí)空上受到了調(diào)控,并具有較強(qiáng)的組織器官特異性,基因的表達(dá)還呈現(xiàn)出細(xì)胞周期依賴的特征。 為了研究激素對(duì)水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié),分別用10 μM IAA和5 μM 6-BA

7、處理萌發(fā)后10天的水稻幼苗,進(jìn)行半定量RT-PCR分析。結(jié)果表明,25個(gè)細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量受到IAA明顯上調(diào),4個(gè)基因的表達(dá)量受IAA明顯下調(diào),11個(gè)基因的表達(dá)受6-BA上調(diào),26個(gè)基因的表達(dá)受6-BA下調(diào)。在整個(gè)細(xì)胞周期進(jìn)程中,生長素和細(xì)胞分裂素單獨(dú)或著同時(shí)調(diào)節(jié)了某些細(xì)胞周期基因的表達(dá)。 為進(jìn)一步研究細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中的作用,選擇Orysa;DEL1基因進(jìn)行了較為詳細(xì)的分析。該基因編碼441個(gè)氨基酸

8、殘基。序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,Orysa;DEL1基因所編碼的氨基酸與其他植物中的E2Fe/DEL1基因所編碼的氨基酸序列同源性較高,含有兩個(gè)保守的DNA結(jié)合區(qū),在每個(gè)結(jié)合區(qū)內(nèi)均包含一個(gè)高度保守的DNA識(shí)別基序(RRxYD)。盡管在Orysa;DEL1中沒有預(yù)測(cè)到核定位信號(hào),亞細(xì)胞定位結(jié)果表明該蛋白定位在細(xì)胞核內(nèi)。 RT-PCR結(jié)果顯示,除在胚乳發(fā)育晚期外,在大部分組織和器官中都檢測(cè)到了該基因的表達(dá),在營養(yǎng)器官的根、幼

9、葉、成熟葉片和節(jié)中表達(dá)量較高,在種子發(fā)育過程中主要在種子發(fā)育早期表達(dá)和胚中表達(dá)。原位雜交結(jié)果顯示該基因在根、幼葉和胚中均有表達(dá)。 分別構(gòu)建Orysa;DEL1基因的正義和RNAi的表達(dá)載體進(jìn)行水稻的遺傳轉(zhuǎn)化,研究該基因的功能。利用掃描電鏡觀察過量表達(dá)Orysa;DEL1的轉(zhuǎn)基因植株葉片,發(fā)現(xiàn)近軸面的表皮毛大量缺失,在轉(zhuǎn)基因植株穎殼上表皮毛亦明顯減少。且表型變化的輕重與該基因表達(dá)量的提高是一致的。 綜上所述,本研究通過比較