水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因的全基因組分析及Orysa;DEL1功能的初步鑒定.pdf

1、細胞分裂是生物體中一個重要的生物學過程。真核生物細胞周期進程調控的分子機制是高度保守的。在真核生物中已經鑒定出細胞周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinases,CDKs)、細胞周期蛋白(cyclins)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CDK inhibitors,CKIs)、成視網膜細胞瘤蛋白(retinoblastomas, Rbs)和E2F、細胞周期蛋白依賴性蛋白激酶亞單位(CDK subunits, CKS

2、s)等多種細胞周期關鍵調節(jié)因子。其中,CDKs在細胞周期調控過程中起到非常重要的作用。高等植物中,在時間和空間上調控細胞分裂的進行對植物體的形態(tài)建成是必需的。而植物激素在調控細胞周期過程中起到重要的作用。迄今對雙子葉植物細胞周期調節(jié)基因的研究較多,但有關單子葉植物水稻中的報道很少。水稻不僅是一種重要的模式植物,也是重要的糧食作物。因此,我們對水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因進行了鑒定和表達分析。研究結果為闡明水稻細胞周期的分子機理及其發(fā)育調控提

3、供了有重要價值的基礎資料。 根據擬南芥基因組信息,利用BLAST軟件從水稻基因組中檢索到90個細胞周期相關基因的序列,其中44個基因編碼細胞周期蛋白,25個基因編碼細胞周期蛋白依賴性激酶,7個基因編碼細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑,9個基因編碼E2F蛋白,2個RB蛋白基因,2個WEE激酶基因和1個CKS基因。在檢索到的90個基因中新命名的或著是對其原有的命名進行更正的有41個基因。通過對水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因的系統(tǒng)進化樹和蛋白質

4、結構分析發(fā)現(xiàn),在水稻和擬南芥中細胞周期關鍵調節(jié)基因之間是非常保守的。 為了研究片段重復與新的細胞周期關鍵基因的產生之間的關系,我們繪制了水稻中CDK、E2F、CKI、CKS、Rb和Wee的不同成員在染色體上的排列分布圖。結果發(fā)現(xiàn)在水稻的12條染色體的7條之間發(fā)生了六次片段重復事件,并且大部分的重復發(fā)生在2、3、10和12號染色體上。染色體片段的重復是產生新基因的基礎,某些基因家族中不同成員的產生是基因組中發(fā)生片斷重復的結果?；?/p>

5、表達模式能夠為研究基因的功能提供重要線索,我們通過半定量RT-PCR方法初步研究了水稻中細胞周期關鍵基因的表達模式。結果表明水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因之間具有不同的表達模式,大部分細胞周期基因在被檢測的多數(shù)組織中均有表達,而某些基因的表達具有一定的組織特異性。同一基因家族成員之間呈現(xiàn)出相似的表達模式,不同基因家族之間的表達模式差異較大。基因的表達模式和系統(tǒng)進化樹分析結果暗示,同一家族的成員之間可能存在著功能上的冗余。 為準確地了解

6、水稻細胞周期關鍵基因的表達模式,隨機選取Orysa;CycA2;1、Orysa;CycB2;2、Orysa;CycU4;4與Orysa;CDKG; 1 四個基因進行了原位雜交分析。原位雜交結果與RT-PCR結果吻合,同時也發(fā)現(xiàn)水稻中細胞周期關鍵調節(jié)基因的表達在時空上受到了調控,并具有較強的組織器官特異性,基因的表達還呈現(xiàn)出細胞周期依賴的特征。 為了研究激素對水稻細胞周期關鍵基因的調節(jié),分別用10 μM IAA和5 μM 6-BA

7、處理萌發(fā)后10天的水稻幼苗,進行半定量RT-PCR分析。結果表明,25個細胞周期關鍵調節(jié)基因的表達量受到IAA明顯上調,4個基因的表達量受IAA明顯下調,11個基因的表達受6-BA上調,26個基因的表達受6-BA下調。在整個細胞周期進程中,生長素和細胞分裂素單獨或著同時調節(jié)了某些細胞周期基因的表達。 為進一步研究細胞周期關鍵調節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中的作用,選擇Orysa;DEL1基因進行了較為詳細的分析。該基因編碼441個氨基酸

8、殘基。序列比對和系統(tǒng)進化樹分析結果表明,Orysa;DEL1基因所編碼的氨基酸與其他植物中的E2Fe/DEL1基因所編碼的氨基酸序列同源性較高,含有兩個保守的DNA結合區(qū),在每個結合區(qū)內均包含一個高度保守的DNA識別基序(RRxYD)。盡管在Orysa;DEL1中沒有預測到核定位信號,亞細胞定位結果表明該蛋白定位在細胞核內。 RT-PCR結果顯示,除在胚乳發(fā)育晚期外,在大部分組織和器官中都檢測到了該基因的表達,在營養(yǎng)器官的根、幼

9、葉、成熟葉片和節(jié)中表達量較高,在種子發(fā)育過程中主要在種子發(fā)育早期表達和胚中表達。原位雜交結果顯示該基因在根、幼葉和胚中均有表達。 分別構建Orysa;DEL1基因的正義和RNAi的表達載體進行水稻的遺傳轉化,研究該基因的功能。利用掃描電鏡觀察過量表達Orysa;DEL1的轉基因植株葉片,發(fā)現(xiàn)近軸面的表皮毛大量缺失,在轉基因植株穎殼上表皮毛亦明顯減少。且表型變化的輕重與該基因表達量的提高是一致的。 綜上所述,本研究通過比較