水稻細(xì)胞周期基因的全基因組分析與Orysa;CycB1;1調(diào)節(jié)胚和胚乳發(fā)育的研究.pdf

1、細(xì)胞分裂是生物體生長發(fā)育的基礎(chǔ)。近年來，細(xì)胞周期的調(diào)控機制逐漸為人們所關(guān)注。在高等植物中，細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子在雙子葉模式植物擬南芥中已經(jīng)被系統(tǒng)分析，但在單子葉模式植物水稻(Oryza sativa)中研究則較少。水稻是我國重要的糧食作物，研究水稻細(xì)胞周期的調(diào)控機制對于有目的的改善水稻的農(nóng)藝性狀(如加速生長、增加株高、改善株型、提高千粒重等)進(jìn)而提高水稻產(chǎn)量有著重要的意義。水稻基因組測序的完成及大量信息學(xué)數(shù)據(jù)的出現(xiàn)為查找水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵

2、調(diào)節(jié)因子提供了方便。為了獲得水稻所有的細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，本研究根據(jù)擬南芥基因組提供的信息，在水稻公共數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列檢索，將檢索到的序列進(jìn)行了信息挖掘，進(jìn)而對水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的表達(dá)模式和功能進(jìn)行了初步研究。 本研究通過序列比對獲得了90個水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子的基因序列。這些調(diào)節(jié)因子包括44個細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)、25個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)、7個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(KRP)、9個E2F

3、轉(zhuǎn)錄因子，另外還有2個成視網(wǎng)膜瘤蛋白(Rb)，2個WEE激酶和1個細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶亞單位(CKS)。對這些調(diào)節(jié)因子的蛋白序列進(jìn)行了聚類分析并系統(tǒng)命名，其中有41個調(diào)控因子的名稱是新命名的或?qū)ζ湓械拿Q進(jìn)行了更正。聚類分析以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，水稻和擬南芥的細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之間不僅在數(shù)目上是保守的，在蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征上同樣比較保守。 為了研究水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中的功能，首先利用半定量RT-PCR

4、的方法初步研究了上述基因在水稻不同組織中的時空表達(dá)模式。根據(jù)表達(dá)模式，水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵凋節(jié)基因大致可分為五大類。這些基因中，同一基因家族成員之間具有相似的表達(dá)模式，而不同基因家族之間表達(dá)模式差異較大。暗示不同家族的細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中可能起著不同的作用，而同一家族的基因成員之間可能存在功能冗余。 為精確地了解水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因所表達(dá)的細(xì)胞和組織，隨機選取Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB2；2

5、、Orysa；CycU4；4與Orysa；CDKG；1四個基因進(jìn)行了原位雜交分析。原位雜交結(jié)果顯示水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因具有時空表達(dá)特異性，特異地在細(xì)胞分裂旺盛的組織如根端分生組織、苗端分生組織以及發(fā)育的胚中表達(dá)。另外，原位雜交結(jié)果與半定量RT-PCR結(jié)果一致，證明通過半定量RT-PCR來研究基因表達(dá)模式的方法是比較可靠的。 為了研究生長素和細(xì)胞分裂素對水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵基因的調(diào)節(jié)作用，利用半定量RT-PCR的方法研究了這兩種激

6、素對上述基因表達(dá)的調(diào)控模式。結(jié)果顯示，生長素調(diào)控表達(dá)的基因有29個，其中有25個基因的表達(dá)水平上調(diào)，4個基因的表達(dá)水平下調(diào)；細(xì)胞分裂素調(diào)控表達(dá)的基因有37個，其中，12個基因表達(dá)上調(diào)，25個基因表達(dá)下調(diào)；在這些表達(dá)變化的基因中，18個基因的表達(dá)同時受到生長素和細(xì)胞分裂素的調(diào)節(jié)。這表明生長素和細(xì)胞分裂素能夠分別或著同時調(diào)節(jié)不同水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。 在種子中高水平表達(dá)的基因可能對種子的發(fā)育起著重要的作用。根據(jù)水稻90個細(xì)

7、胞周期關(guān)鍵基因的表達(dá)模式，選取在種子中高水平表達(dá)的7個基因--Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB1；1、Orysa；CycB2；2、Orysa；CDKE、Orysa；DEL1、Orysa；DP1以及Orysa；E2F4，通過遺傳轉(zhuǎn)化分析其在水稻種子發(fā)育過程中的功能。觀察轉(zhuǎn)基因水稻的表型發(fā)現(xiàn)Orysa；CycB1；1相關(guān)轉(zhuǎn)基因水稻植株的生殖發(fā)育異常，因此，對Orysa；CycB1；1的功能進(jìn)行了進(jìn)一步的研究。 對轉(zhuǎn)基

8、因植株進(jìn)行表型分析發(fā)現(xiàn)，Pubi：：CycB1；1RNAi轉(zhuǎn)基因水稻生殖發(fā)育異常，表現(xiàn)為部分花粉和子房敗育、結(jié)實率降低、種子發(fā)育異常、胚乳的發(fā)育受到抑制而胚的生長得到促進(jìn)。組織學(xué)分析顯示，授粉后3天(3 DAP)的轉(zhuǎn)基因水稻種子胚乳發(fā)育出現(xiàn)異常，胚與對照相比沒有顯著差異，9 DAP的轉(zhuǎn)基因種子中胚乳幾乎消失，而胚與對照相比體積則增大三至四倍。在胚乳中特異敲除Orysa；CycB1；1發(fā)現(xiàn)，PGluA-1::CycB1；1RNAi轉(zhuǎn)基因水

9、稻能夠產(chǎn)生與上述表型類似的種子，表明Orysa；CycB1；1直接調(diào)控水稻胚乳的發(fā)育，同時影響胚的發(fā)育。統(tǒng)計結(jié)果顯示，Pubi：：CycB1；1RNAi轉(zhuǎn)基因水稻種子胚體積增大主要是由于細(xì)胞體積增加所致，與細(xì)胞數(shù)目無關(guān)。 半定量RT-PCR、熒光實時定量PCR、原位雜交以及PCycB1；1::GUS轉(zhuǎn)基因水稻種子的組織學(xué)染色結(jié)果顯示，Orysa；CycB1；1在分裂旺盛的組織和細(xì)胞中表達(dá)，尤其在發(fā)育早期種子的胚和胚乳中均表達(dá)，暗

10、示該基因?qū)λ痉N子胚和胚乳的發(fā)育起調(diào)控作用。 對PGluA-1::CycB1；1RNAi轉(zhuǎn)基因水稻胚乳的熒光實時定量PCR分析結(jié)果顯示，種子發(fā)育相關(guān)基因FIE和GW2的表達(dá)量上調(diào)。芯片分析結(jié)果表明，Pubi：：CycB1；1RNAi轉(zhuǎn)基因水稻胚中，一些與發(fā)育進(jìn)程、形態(tài)建成及細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)等相關(guān)的基因表達(dá)水平變化顯著。暗示這些基因的表達(dá)可能受Orysa；CycB1；1調(diào)節(jié)。 綜上所述，得出以下結(jié)論：水稻與擬南芥的細(xì)胞周期關(guān)

11、鍵調(diào)節(jié)基因在數(shù)目及結(jié)構(gòu)上相當(dāng)保守；不同家族的水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中起著不同的作用，而同一家族成員之間可能存在功能冗余現(xiàn)象；生長素和細(xì)胞分裂素能夠分別或著同時調(diào)節(jié)不同水稻細(xì)胞周期關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因的表達(dá)；Orysa；CycB1；1的正常表達(dá)為水稻生殖發(fā)育所必需，該基因直接調(diào)控水稻胚乳的發(fā)育，并影響胚的發(fā)育；Orysa；CycB1；1可能通過調(diào)節(jié)FIE和GW2基因調(diào)控胚乳的發(fā)育；Orysa；CycB1；1可能通過調(diào)節(jié)與發(fā)育進(jìn)程、