水稻細胞周期基因的全基因組分析與Orysa;CycB1;1調節(jié)胚和胚乳發(fā)育的研究.pdf

1、細胞分裂是生物體生長發(fā)育的基礎。近年來，細胞周期的調控機制逐漸為人們所關注。在高等植物中，細胞周期關鍵調節(jié)因子在雙子葉模式植物擬南芥中已經被系統(tǒng)分析，但在單子葉模式植物水稻(Oryza sativa)中研究則較少。水稻是我國重要的糧食作物，研究水稻細胞周期的調控機制對于有目的的改善水稻的農藝性狀(如加速生長、增加株高、改善株型、提高千粒重等)進而提高水稻產量有著重要的意義。水稻基因組測序的完成及大量信息學數據的出現為查找水稻細胞周期關鍵

2、調節(jié)因子提供了方便。為了獲得水稻所有的細胞周期關鍵調節(jié)因子，本研究根據擬南芥基因組提供的信息，在水稻公共數據庫中進行序列檢索，將檢索到的序列進行了信息挖掘，進而對水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因的表達模式和功能進行了初步研究。 本研究通過序列比對獲得了90個水稻細胞周期關鍵調節(jié)因子的基因序列。這些調節(jié)因子包括44個細胞周期蛋白(Cyclin)、25個細胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)、7個細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(KRP)、9個E2F

3、轉錄因子，另外還有2個成視網膜瘤蛋白(Rb)，2個WEE激酶和1個細胞周期蛋白依賴性激酶亞單位(CKS)。對這些調節(jié)因子的蛋白序列進行了聚類分析并系統(tǒng)命名，其中有41個調控因子的名稱是新命名的或對其原有的名稱進行了更正。聚類分析以及蛋白質結構分析發(fā)現，水稻和擬南芥的細胞周期關鍵調節(jié)因子之間不僅在數目上是保守的，在蛋白序列和結構特征上同樣比較保守。 為了研究水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中的功能，首先利用半定量RT-PCR

4、的方法初步研究了上述基因在水稻不同組織中的時空表達模式。根據表達模式，水稻細胞周期關鍵凋節(jié)基因大致可分為五大類。這些基因中，同一基因家族成員之間具有相似的表達模式，而不同基因家族之間表達模式差異較大。暗示不同家族的細胞周期關鍵調節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中可能起著不同的作用，而同一家族的基因成員之間可能存在功能冗余。 為精確地了解水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因所表達的細胞和組織，隨機選取Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB2；2

5、、Orysa；CycU4；4與Orysa；CDKG；1四個基因進行了原位雜交分析。原位雜交結果顯示水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因具有時空表達特異性，特異地在細胞分裂旺盛的組織如根端分生組織、苗端分生組織以及發(fā)育的胚中表達。另外，原位雜交結果與半定量RT-PCR結果一致，證明通過半定量RT-PCR來研究基因表達模式的方法是比較可靠的。 為了研究生長素和細胞分裂素對水稻細胞周期關鍵基因的調節(jié)作用，利用半定量RT-PCR的方法研究了這兩種激

6、素對上述基因表達的調控模式。結果顯示，生長素調控表達的基因有29個，其中有25個基因的表達水平上調，4個基因的表達水平下調；細胞分裂素調控表達的基因有37個，其中，12個基因表達上調，25個基因表達下調；在這些表達變化的基因中，18個基因的表達同時受到生長素和細胞分裂素的調節(jié)。這表明生長素和細胞分裂素能夠分別或著同時調節(jié)不同水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因的表達。 在種子中高水平表達的基因可能對種子的發(fā)育起著重要的作用。根據水稻90個細

7、胞周期關鍵基因的表達模式，選取在種子中高水平表達的7個基因--Orysa；CycA2；1、Orysa；CycB1；1、Orysa；CycB2；2、Orysa；CDKE、Orysa；DEL1、Orysa；DP1以及Orysa；E2F4，通過遺傳轉化分析其在水稻種子發(fā)育過程中的功能。觀察轉基因水稻的表型發(fā)現Orysa；CycB1；1相關轉基因水稻植株的生殖發(fā)育異常，因此，對Orysa；CycB1；1的功能進行了進一步的研究。 對轉基

8、因植株進行表型分析發(fā)現，Pubi：：CycB1；1RNAi轉基因水稻生殖發(fā)育異常，表現為部分花粉和子房敗育、結實率降低、種子發(fā)育異常、胚乳的發(fā)育受到抑制而胚的生長得到促進。組織學分析顯示，授粉后3天(3 DAP)的轉基因水稻種子胚乳發(fā)育出現異常，胚與對照相比沒有顯著差異，9 DAP的轉基因種子中胚乳幾乎消失，而胚與對照相比體積則增大三至四倍。在胚乳中特異敲除Orysa；CycB1；1發(fā)現，PGluA-1::CycB1；1RNAi轉基因水

9、稻能夠產生與上述表型類似的種子，表明Orysa；CycB1；1直接調控水稻胚乳的發(fā)育，同時影響胚的發(fā)育。統(tǒng)計結果顯示，Pubi：：CycB1；1RNAi轉基因水稻種子胚體積增大主要是由于細胞體積增加所致，與細胞數目無關。 半定量RT-PCR、熒光實時定量PCR、原位雜交以及PCycB1；1::GUS轉基因水稻種子的組織學染色結果顯示，Orysa；CycB1；1在分裂旺盛的組織和細胞中表達，尤其在發(fā)育早期種子的胚和胚乳中均表達，暗

10、示該基因對水稻種子胚和胚乳的發(fā)育起調控作用。 對PGluA-1::CycB1；1RNAi轉基因水稻胚乳的熒光實時定量PCR分析結果顯示，種子發(fā)育相關基因FIE和GW2的表達量上調。芯片分析結果表明，Pubi：：CycB1；1RNAi轉基因水稻胚中，一些與發(fā)育進程、形態(tài)建成及細胞壁組織結構等相關的基因表達水平變化顯著。暗示這些基因的表達可能受Orysa；CycB1；1調節(jié)。 綜上所述，得出以下結論：水稻與擬南芥的細胞周期關

11、鍵調節(jié)基因在數目及結構上相當保守；不同家族的水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因在水稻發(fā)育過程中起著不同的作用，而同一家族成員之間可能存在功能冗余現象；生長素和細胞分裂素能夠分別或著同時調節(jié)不同水稻細胞周期關鍵調節(jié)基因的表達；Orysa；CycB1；1的正常表達為水稻生殖發(fā)育所必需，該基因直接調控水稻胚乳的發(fā)育，并影響胚的發(fā)育；Orysa；CycB1；1可能通過調節(jié)FIE和GW2基因調控胚乳的發(fā)育；Orysa；CycB1；1可能通過調節(jié)與發(fā)育進程、