水稻果膠裂解酶基因DEL1的克隆和功能研究.pdf

1、果膠是植物細(xì)胞壁的重要組成成份，也是植物細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜的多糖。果膠裂解酶作為眾多果膠降解酶之一，能夠通過(guò)β-消除作用將去酯化的同聚半乳糖醛酸降解成一個(gè)短鏈的果膠分子和一個(gè)4，5-不飽和寡聚半乳糖醛酸。到目前為止，盡管許多植物中都報(bào)道了果膠裂解酶基因的功能，主要表現(xiàn)在參與花粉、花藥和雌蕊的發(fā)育、果實(shí)軟化及成熟、抗病和植物器官或組織發(fā)育等方面，但在水稻中功能還鮮有報(bào)道。本研究在水稻甲基磺酸乙酯(EMS)誘變突變體庫(kù)中篩選到一個(gè)水稻矮稈、

2、葉片早衰突變體，命名為dell(dwarf and early-senescence leaf1)。通過(guò)生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)、遺傳學(xué)、分子生物學(xué)以及生物信息學(xué)分析等試驗(yàn)方法，剖析了其突變表型變化的分子機(jī)理。主要研究結(jié)果如下:
　　1.突變體del1在整個(gè)生育期表現(xiàn)出發(fā)育緩慢、植株矮小、根長(zhǎng)變短、分蘗數(shù)減少等表型。石蠟切片分析結(jié)果表明，造成突變體del1植株矮小的原因是細(xì)胞數(shù)目減少導(dǎo)致的。流式細(xì)胞儀結(jié)果表明突變體del1細(xì)胞數(shù)目減少是由于

3、細(xì)胞周期G1期受到阻滯引起的;
　　2.突變體del1同時(shí)也表現(xiàn)出葉片早衰的表型，在播種后5天葉尖及葉片邊緣發(fā)生黃化，隨著生長(zhǎng)發(fā)育葉的進(jìn)行，葉片衰老表型更加嚴(yán)重，到了成熟期葉尖甚至出現(xiàn)撕裂表型。透射電鏡觀察突變體del1中葉綠體出現(xiàn)部分降解，類囊體排列紊亂，片層排列不規(guī)則等現(xiàn)象。同時(shí)，突變體del1中葉綠素含量和光合作用都顯著下降，衰老相關(guān)基因的表達(dá)顯著上升。臺(tái)盼藍(lán)染色及TUNEL實(shí)驗(yàn)表明，突變體del1衰老的葉片中細(xì)胞程序化死亡

4、增加;NBT和DAB染色觀察發(fā)現(xiàn)，del1突變體中活性氧含量顯著升高，且電解質(zhì)滲透率也顯著升高。同時(shí)，活性氧相關(guān)酶活性及清除活性氧相關(guān)基因也顯著升高。這些結(jié)果表明，突變體del1葉片的衰老主要是由于活性氧的積累導(dǎo)致的;
　　3.遺傳分析表明，del1是由單一核基因控制的隱性性狀。以del1為母本，TN1為父本雜交獲得F2定位群體，選取30株突變表型的單株進(jìn)行初定位，將DEL1定位在10號(hào)染色體長(zhǎng)壁上位于標(biāo)記M1和M14之間。進(jìn)一步

5、擴(kuò)大群體（1081株突變表型單株）將DEL1定位于標(biāo)記M7和M8之間約45kb的物理距離范圍內(nèi)，該區(qū)間包含8個(gè)開(kāi)放閱讀框。并進(jìn)一步通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)第五個(gè)開(kāi)放閱讀框的第三個(gè)外顯子發(fā)生一個(gè)堿基替換（G替換成T），導(dǎo)致氨基酸由色氨酸(Trp)變成亮氨酸(Leu)。序列分析表明DEL1編碼一個(gè)果膠裂解酶前體基因，cDNA全長(zhǎng)為1476bp，編碼491個(gè)氨基酸。遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證明，DEL1基因能夠恢復(fù)矮稈和葉片早衰的表型;
　　4.生物信息學(xué)分析

6、DEL1蛋白序列含有一個(gè)PelC結(jié)構(gòu)域，且保守位點(diǎn)與植物同源性非常高。進(jìn)化分析表明，DEL1與擬南芥業(yè)已報(bào)到的易感白粉病PMR6基因在進(jìn)化上親緣關(guān)系很近，但DEL1卻沒(méi)有表現(xiàn)出抗病的特性，表明果膠裂解酶基因在單子葉和雙子葉植物中已出現(xiàn)功能分化;
　　5.DEL1基因在水稻各個(gè)組織器官?gòu)V泛表達(dá)。其中，在莖，根和鞘等伸長(zhǎng)部位表達(dá)量很高;
　　6.果膠酶活性實(shí)驗(yàn)表明，突變體del1的酶活性要較野生型顯著降低。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，突變

7、體del1細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，胞間層和次生細(xì)胞壁厚度顯著下降，而初生細(xì)胞壁顯著升高。同時(shí)，果膠、纖維素、半纖維素及7種中性單糖都發(fā)生了顯著的變化。免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，突變體del1果膠甲酯化顯著升高;
　　7.轉(zhuǎn)錄組分析表明，突變體del1中許多細(xì)胞壁相關(guān)和衰老相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生變化，表明DEL1可能通過(guò)間接的方式參與水稻植物發(fā)育和葉片衰老相關(guān)的通路中。
　　以上結(jié)果說(shuō)明:突變體del1矮稈、早衰表型是由于果膠裂解酶基