水稻矮化劍葉卷曲基因DCFL1的圖位克隆和功能研究.pdf

1、株高是水稻最重要的農(nóng)藝性狀之一，直接影響水稻的抗倒伏和產(chǎn)量，大量矮桿突變體的出現(xiàn)引發(fā)了“第二次綠色革命”。劍葉是水稻最重要的功能葉，其形態(tài)特征關(guān)系到葉片間的通透性和光能利用率，直接影響水稻灌漿速度和籽粒飽滿度。因此，了解水稻株高的遺傳模式和劍葉發(fā)育的分子機(jī)理對(duì)水稻株型改良和豐產(chǎn)具有極其重要的意義。利用EMS誘變秈型水稻恢復(fù)系縉恢10號(hào)，從其后代鑒定到一個(gè)矮化劍葉基部特異卷曲突變體，暫命名為dcfl1(dwarf and curled f

2、lag leaf1)。本文對(duì)dcfl1進(jìn)行了表型和細(xì)胞學(xué)觀察，光合色素含量和光合參數(shù)分析，并開(kāi)展了基因定位、圖位克隆、表達(dá)模式分析和功能驗(yàn)證等研究。主要結(jié)果如下：
　　1. dcfl1的表型分析和農(nóng)藝性狀調(diào)查
　　突變體dcfl1全生育期表現(xiàn)出矮化性狀，dcfl1的細(xì)胞長(zhǎng)度明顯比野生型短，達(dá)到了極顯著水平，而細(xì)胞寬度無(wú)顯著差異。抽穗期dcfl1劍葉的葉片和葉鞘連接處硬化，劍葉基部展開(kāi)受阻，半邊葉片向內(nèi)卷曲。劍葉上部和中部正常

3、，其他葉片也正常。農(nóng)藝性狀分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，dcfl1的有效穗數(shù)為14.2，極顯著高于野生型的11.6，穗粒數(shù)、實(shí)粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和千粒重等則無(wú)顯著變化。
　　2. dcfl1的光合色素含量和光合參數(shù)測(cè)定
　　開(kāi)花期對(duì)光合色素含量測(cè)定結(jié)果顯示，dcfl1的劍葉、倒2葉和倒3葉的葉綠素 a含量均極顯著高于野生型，類胡蘿卜素含量也略有升高，但僅劍葉達(dá)到極顯著差異水平，葉綠素 b含量則無(wú)顯著變化。光合參數(shù)測(cè)定發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，

4、 dcfl1的胞間CO2濃度無(wú)明顯變化，凈光合速率Pn、氣孔導(dǎo)度Gs和蒸騰速率Tr則顯著降低。
　　3. dcfl1的遺傳分析與基因定位
　　利用雜交組合西農(nóng)1A/dcfl1的 F1、F2群體進(jìn)行遺傳分析，表明dcfl1突變表型受1對(duì)隱性核基因控制。以西農(nóng)1A/dcfl1雜交組合的620株F2隱性單株為定位群體，利用SSR標(biāo)記和InDel標(biāo)記進(jìn)行基因定位，最終將DCFL1定位在第3染色體Ind03-11和Ind03-6之間，

5、物理距離約為78kb。
　　4. DCFL1基因的克隆與蛋白分析
　　對(duì)定位區(qū)間內(nèi)的15個(gè)注釋基因進(jìn)行基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)LOC_Os03g04680在dcfl1中發(fā)生了一個(gè)G-A的堿基替換，導(dǎo)致編碼的氨基酸從半胱氨酸變成了酪氨酸，初步確定為DCFL1的候選基因。DCFL1編碼細(xì)胞色素P450加單氧酶OsCYP96B4，屬于CYP86家族中的CYP96亞家族。
　　5. DCFL1候選基因的確定
　　利用野生型DCFL

6、1基因組片段包括上游2875bp、編碼框和下游1315bp構(gòu)建互補(bǔ)表達(dá)載體，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化突變體 dcfl1。在轉(zhuǎn)基因植株中，我們共鑒定了12株陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株，表型觀察發(fā)現(xiàn)突變體表型得以恢復(fù)，確定了LOC_Os03g04680是DCFL1基因。
　　6. DCFL1基因的表達(dá)模式分析
　　通過(guò)半定量RT-PCR和qPCR等技術(shù)進(jìn)行表達(dá)模式分析，結(jié)果表明DCFL1在根、莖、葉和穗中都有表達(dá)；在葉片和葉鞘中表達(dá)量較高，其

7、中，劍葉葉鞘表達(dá)量最高。利用 GUS試驗(yàn)進(jìn)一步探究 DCFL1基因表達(dá)模式。GUS染色結(jié)果表明DCFL1基因在各器官均有表達(dá)，這與半定量RT-PCR和qPCR結(jié)果一致。
　　7. DCFL1基因與激素的關(guān)系
　　激素處理實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同濃度的BR和GA3均無(wú)法使突變體dcfl1和等位突變體dcfl1-1矮化表型得以恢復(fù)。說(shuō)明兩個(gè)突變體的矮化表型不受外源BR和GA3的影響，但在沒(méi)有驗(yàn)證其他植物激素的響應(yīng)以及沒(méi)有檢測(cè)突變體 dcfl

8、1和突變體dcfl1-1內(nèi)源激素的前提下，不能排除DCFL1參與植物激素代謝途徑的可能性。
　　8. DCFL1基因可能參與表皮蠟質(zhì)的合成
　　對(duì)突變體 dcfl1卷曲的劍葉基部表皮進(jìn)行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn) dcfl1的兩個(gè)小葉脈之間存在溝壑，導(dǎo)致dcfl1表皮蠟質(zhì)覆蓋面積減少。葉綠素浸析試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)dcfl1的表皮滲透性升高，導(dǎo)致葉綠素比野生型更容易提取出來(lái)，暗示著dcfl1表皮蠟質(zhì)含量要低于野生型。這些結(jié)果表明DCFL1可能