水稻黃葉基因YL1的圖位克隆和功能研究.pdf

1、水稻是世界上重要的糧食作物之一，其產(chǎn)量大部分來自于葉片的光合作用。葉綠體是光合作用的場所，葉綠體正常的生長發(fā)育對于水稻進(jìn)行正常的光合作用具有重要作用。當(dāng)葉綠體發(fā)育出現(xiàn)異常往往會導(dǎo)致葉色發(fā)生變異，影響水稻的光合作用，從而使水稻產(chǎn)量降低。因此利用水稻葉色突變體可以進(jìn)行基因定位和克隆，鑒定葉綠體發(fā)育相關(guān)基因。通過基因工程手段提高水稻光合作用，增加水稻產(chǎn)量，既具有理論意義，又有潛在的實(shí)際利用價值。
　　本研究以水稻品種蜀恢498經(jīng)自然突變

2、產(chǎn)生的黃葉突變體(yellow leaf1，yl1)為材料，對其葉色性狀和葉綠體結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，通過圖位克隆的方法鑒定突變的目的基因。主要研究結(jié)果如下:
　　1.通過觀察發(fā)現(xiàn)yl1黃葉突變體在全生育期葉片都表現(xiàn)為黃色，在苗期、分蘗期和成熟期突變體的葉綠素含量相比野生型都明顯減少，葉綠體的超顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)突變體的葉綠體中基粒片層數(shù)和類囊體相比野生型減少很多。
　　2.遺傳分析發(fā)現(xiàn)該黃葉突變體受單隱性核基因控制的，采用圖位克隆的

3、方法將目的基因定位到水稻第1號染色體長臂端29kb的范圍內(nèi)。測序發(fā)現(xiàn)在突變體中LOC_Os01g73450的第5外顯子有一個單堿基替換，導(dǎo)致精氨酸變?yōu)榘腚装彼??；パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)和基因敲除實(shí)驗(yàn)證明了該基因就是目的基因。
　　3.qRT-PCR的結(jié)果顯示，YL1主要在葉片、葉鞘和穗中表達(dá)，尤其葉片中表達(dá)量最高，而在根和莖中表達(dá)量很低。在突變體中YL1的表達(dá)量相比野生型也明顯降低。從48小時表達(dá)量變化來看，YL1的表達(dá)受到光的誘導(dǎo)，在光照條件下

4、的表達(dá)量明顯高于黑暗條件。苗期突變體中與光合作用、葉綠體發(fā)育以及葉綠素代謝相關(guān)的基因與野生型相比表達(dá)量明顯降低。
　　4.亞細(xì)胞定位觀察發(fā)現(xiàn)，YL1蛋白定位在葉綠體中。原核表達(dá)YL1基因，確認(rèn)該基因編碼的蛋白質(zhì)大小約37kD。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，YL1在水稻中是一個尿苷酸激酶，在細(xì)菌和植物中很保守。對43份水稻進(jìn)行測序發(fā)現(xiàn)YL1的序列變異主要位于非編碼區(qū)。
　　5.通過對蔗糖、可溶性糖以及淀粉含量測定發(fā)現(xiàn)，突變體中合成的碳水