水稻調(diào)控花器官形態(tài)特征關(guān)鍵基因DFO1的圖位克隆與功能分析.pdf

1、禾本科植物中包括很多重要的糧食作物:水稻、小麥、大麥和玉米等。其中，水稻一直被作為單子葉（禾本科）植物的模式植物來進(jìn)行研究。水稻是我國重要的糧食作物，其花器官的形態(tài)發(fā)育對(duì)其產(chǎn)量至關(guān)重要。植物花發(fā)育機(jī)制的探索起始于對(duì)擬南芥、雙魚草等雙子葉植物的研究。目前，比較完善的機(jī)制是基于擬南芥花發(fā)育的“ABC”模型。在單子葉植物中，花發(fā)育的研究相對(duì)于雙子葉植物而言稍微落后。近年來，對(duì)水稻花發(fā)育相關(guān)突變體的研究，使水稻花發(fā)育的調(diào)控機(jī)制逐漸清晰，已經(jīng)逐步

2、建立了適合水稻花發(fā)育的“ABCDE”模型?，F(xiàn)有的研究表明，水稻小花的漿片是雙子葉花瓣的同源物，但對(duì)于內(nèi)外稃是擬南芥萼片的同源物的觀點(diǎn)一直存在爭(zhēng)論。此外，在擬南芥中，鑒定了一些與表觀遺傳相關(guān)的基因，這些基因也參與調(diào)控花器官的形態(tài)建成。而在水稻中，除了MADS-box基因參與調(diào)控水稻花器官的形態(tài)建成外，其他的調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此，進(jìn)一步全面闡述水稻花發(fā)育的調(diào)控機(jī)理，需要鑒定更多的參與花器官發(fā)育的基因。而鑒定水稻花器官內(nèi)外稃發(fā)育相關(guān)的突變體

3、對(duì)于確定內(nèi)外稃的同一性具有重要的理論意義。本研究對(duì)一個(gè)水稻花器官發(fā)育異常的隱性突變體dfo1進(jìn)行了詳細(xì)的表型考察，并對(duì)其產(chǎn)生花器官突變的分子機(jī)制進(jìn)行了深入的研究。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　(1)通過輻射93-11（秈稻）篩選到了兩份表型類似的突變體。突變體較野生型營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期沒有明顯差異，抽穗期稍延遲，成熟期株高變矮且花器官發(fā)育畸形。具體表現(xiàn)為內(nèi)稃縮小，向花中心彎曲;漿片向雌蕊同源轉(zhuǎn)換;雄蕊數(shù)目減少并且雌蕊化;雌蕊數(shù)目增加

4、且異位生長(zhǎng)。根據(jù)突變表型，我們將突變體命名為dfo1（dformed flower organ1）。dfo1與93-11正反交遺傳分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)1代植株表現(xiàn)為野生型，F(xiàn)2代分離群體中花器官正常表型與突變表型的個(gè)體比例約為3∶1，說明該突變性狀受一對(duì)隱性單基因控制。掃描電鏡觀察幼穗發(fā)現(xiàn)dfo1突變體在幼穗原基時(shí)期就表現(xiàn)為花器官原基發(fā)育延遲和畸形。另外，野生型的內(nèi)稃頁邊組織為光滑的表皮細(xì)胞，而dfo1突變體的內(nèi)稃頁邊組織具有類似野生型子房表皮

5、細(xì)胞的特征，同時(shí)有類似柱頭狀的結(jié)構(gòu)在頁邊組織的頂端著生。上述表型觀察表明dfo1突變體中花器官發(fā)生了同源轉(zhuǎn)換和異位生長(zhǎng)的現(xiàn)象。
　　(2)采用圖位克隆的方式獲得了DFO1基因。利用dfo1-1與02428 F2群體中分離的1058個(gè)隱性極端個(gè)體將目的基因定位到60 kb范圍之內(nèi)。通過Rice-GAAS預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)該區(qū)域共有14個(gè)開放閱讀框（ORFs），基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)dfo1-1中第2個(gè)ORF出現(xiàn)單堿基的替換，而dfo1-2中在該ORF

6、發(fā)生了單堿基的缺失，這兩種突變均造成了蛋白翻譯的提前終止。功能分析發(fā)現(xiàn)該ORF編碼一個(gè)擬南芥EMBRONIC FLOWER1(EMF1)的同源蛋白(OsEMF1)。通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)驗(yàn)證確定OsEMF1就是DFO1基因。
　　(3) Real-time PCR分析發(fā)現(xiàn)DFO1在水稻根、莖、葉和穗中組成型表達(dá)。進(jìn)一步通過pDFO1∷GUS轉(zhuǎn)基因苗的GUS組織染色表明DFO1在水稻的各個(gè)器官中表達(dá)。同源比對(duì)發(fā)現(xiàn)DFO1與擬南芥的EMF1具

7、有一定的同源性，但是相似度較低，只有三個(gè)區(qū)域具有保守性。蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)DFO1有四個(gè)重疊的核定位信號(hào)(NLS)、一個(gè)P-loop和一個(gè)LXXLL基序。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明DFO1定位在細(xì)胞核中，同時(shí)發(fā)現(xiàn)328-410位氨基酸對(duì)于DFO1定位到細(xì)胞核中是必需的。酵母轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明DFO1的C末端的LXXLL基序具有抑制轉(zhuǎn)錄激活的特性。我們認(rèn)為，DFO1編碼一個(gè)核蛋白。
　　(4)花器官特征基因表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)C-類基因在突變體中表達(dá)上調(diào)并

8、且在內(nèi)稃中異位表達(dá)，mRNA原位雜交表明OsMADS58在突變體的內(nèi)外稃中異位表達(dá)。過表達(dá)OsMADS58的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出部分dfo1的表型，表明DFO1可能負(fù)調(diào)控OsMADS58的表達(dá)。
　　(5)酵母雙雜交、體外Pull-down和BiFC實(shí)驗(yàn)表明DFO1與水稻的PcG蛋白OsMSI1和OsiEZ1互作，推測(cè)DFO1可能參與PeG蛋白介導(dǎo)的組蛋白H3K27的三甲基化(H3K27me3)。ChIP-real-time PCR結(jié)