水稻籽粒中調(diào)控造粉體發(fā)育關(guān)鍵基因FLO7的圖位克隆和功能分析.pdf

1、谷類中淀粉含量占種子總重量的90％以上，因此淀粉的積累對(duì)于作物產(chǎn)量和品質(zhì)的形成具有極為重要的意義。淀粉的形成是一個(gè)復(fù)雜且精密的過(guò)程，需要許多酶類和調(diào)控因子的參與，最終淀粉在造粉體內(nèi)被轉(zhuǎn)化為淀粉顆粒并儲(chǔ)存起來(lái)。這一模型已經(jīng)初步建立，但隨著越來(lái)越多該模型外的粉質(zhì)基因的發(fā)現(xiàn)，建立新的多網(wǎng)絡(luò)交叉模型就顯得尤為重要。
　　為尋找淀粉合成相關(guān)的新基因，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的日本晴T-DNA插入突變體庫(kù)進(jìn)行了篩選，從中篩到了一個(gè)粉質(zhì)突變體，命名為f

2、lo7，細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)位于胚乳外周的造粉體發(fā)育受到影響。通過(guò)圖位克隆和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)的手段，成功克隆了FLO7基因，它編碼一個(gè)含364個(gè)氨基酸的未知功能的蛋白。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果表明其N端含有一個(gè)質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，C端含有一個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)域1338(DUF1338)。亞細(xì)胞定位結(jié)果證實(shí)FLO7存在于造粉體基質(zhì)中。組織表達(dá)分析顯示FLO7在水稻中是組成型表達(dá)的，在胚乳中表達(dá)量最高，且特異地在胚乳外周表達(dá)。體內(nèi)與體外蛋白實(shí)驗(yàn)表明突變后的蛋白穩(wěn)定性下降

3、。具體研究結(jié)果如下:
　　1.突變體flo7成熟種子不透明，橫截面觀察顯示主要是胚乳外圍粉質(zhì)。掃描電鏡結(jié)果表明，flo7胚乳外圍淀粉顆粒變圓，排列比較疏松。與野生型相比，flo7灌漿速率降低，千粒重只有野生型的87％左右。突變體種子生理生化測(cè)定結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)和氨基酸含量顯著下降，脂肪含量提高44.3％，支鏈淀粉聚合度也發(fā)生了明顯改變。
　　2.透射電鏡觀察結(jié)果表明，隨著胚乳的發(fā)育，突變體造粉體中的淀粉顆粒能夠正常的變大，但

4、是不能緊密排列，淀粉顆粒之間存在空隙，造粉體的填充速率降低。半薄切片觀察結(jié)果顯示在胚乳發(fā)育中期，突變體胚乳中復(fù)合淀粉顆粒碎裂，不能形成緊密排列的多邊形。這些結(jié)果說(shuō)明FLO7對(duì)于水稻胚乳中正常復(fù)合淀粉顆粒形態(tài)的形成起著關(guān)鍵的作用。
　　3.將突變體flo7與秈稻品種培矮64配制雜交組合。利用F2群體將突變基因定位在第10染色體長(zhǎng)臂標(biāo)記Z5和Z24之間的83 kb內(nèi)，經(jīng)過(guò)RGAP網(wǎng)站預(yù)測(cè)該區(qū)間含有16個(gè)基因，基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)只有基因Os

5、10g0463800內(nèi)部存在一個(gè)單堿基的替換，造成RNA水平上剪切紊亂，蛋白翻譯提前終止。功能互補(bǔ)結(jié)果證實(shí)Os10g0463800即為我們尋找的控制造粉體發(fā)育的目標(biāo)基因，將其命名為FLO7（Floury Endosperm7）。它編碼一個(gè)包含364個(gè)氨基酸的未知功能的蛋白質(zhì)，在水稻中是單拷貝的，從低等植物到高等植物都是很保守的。該蛋白在N端有一個(gè)質(zhì)體定位信號(hào)肽，同時(shí)C端含有一個(gè)未知功能結(jié)構(gòu)域1338(DUF1338)。
　　4.熒

6、光定量PCR結(jié)果顯示，F(xiàn)LO7在根、莖、葉、葉鞘、穗子和胚乳中都有所表達(dá)，在胚乳中表達(dá)量最高。不同灌漿時(shí)期中FLO7蛋白含量隨著種子的發(fā)育逐步積累增多。GUS組織染色和定量結(jié)果一致。原位雜交結(jié)果顯示，F(xiàn)LO7主要在胚乳的外圍表達(dá)。由此可以推斷突變體的表型是由FLO7在胚乳中的特異性表達(dá)決定的。
　　5.亞細(xì)胞定位研究證明FLO7 N端的信號(hào)肽對(duì)其正確定位到葉綠體起著關(guān)鍵作用。在水稻轉(zhuǎn)基因植株中，F(xiàn)LO7蛋白被定位于胚乳造粉體的基質(zhì)

7、中。綜合以上結(jié)果，F(xiàn)LO7蛋白對(duì)造粉體的發(fā)育確實(shí)起著至關(guān)重要的作用。通過(guò)連續(xù)觀察野生型蛋白與突變體蛋白在煙草葉片中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體蛋白的穩(wěn)定性下降。相同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果在水稻原生質(zhì)體系統(tǒng)中被再次驗(yàn)證。因此C端缺失的氨基酸對(duì)于FLO7蛋白的穩(wěn)定積累是必需的。同時(shí)利用熒光定量PCR的方法檢測(cè)了淀粉合成相關(guān)基因在野生型和突變體flo7胚乳中的表達(dá)情況，這些基因的表達(dá)基本沒(méi)有發(fā)生太大變化。酶譜分析結(jié)果表明，參與淀粉合成的相關(guān)酶類也