水稻籽粒中控制淀粉合成關(guān)鍵基因OsPDILl-1的圖位克隆及功能分析.pdf

1、谷類作物種子內(nèi)淀粉的積累對(duì)于作物產(chǎn)量的形成具有極為重要的意義。種子淀粉的生物合成是各種酶催化的過程，這一模型已經(jīng)初步建立。然而隨著越來越多的該模型外的粉質(zhì)突變體基因的發(fā)現(xiàn)，新的多網(wǎng)絡(luò)交叉模型的建立顯得尤為重要。為尋找淀粉合成相關(guān)的新基因，我們對(duì)實(shí)驗(yàn)室已有的日本晴T-DNA插入突變體庫和日本晴、93-11輻射誘變突變體庫進(jìn)行了篩選（總共篩選11400份變突變體材料），并鑒定到多份粉質(zhì)突變體。本文針對(duì)其中的一個(gè)突變體——T3612，進(jìn)行詳細(xì)

2、研究，并取得如下研究進(jìn)展:
　　T3612種子外觀及橫截面呈現(xiàn)不透明粉質(zhì)表型，與野生型日本晴相比較千粒重下降33.7％;突變體種子橫截面掃描電鏡觀察結(jié)果顯示，T3612淀粉顆粒變圓、變小，而且排列疏松;突變體種子生理生化測(cè)定結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)和脂肪含量上升大約15％，直鏈淀粉含量是野生型的80％。
　　通過圖位克隆的方法，利用T3612/南京11F2群體中1242個(gè)粉質(zhì)表型極端個(gè)體，將目的基因定位于第11染色體短臂25cM處，

3、位于OSJNBa0058P12BAC克隆的T3612-54和T3612-31兩個(gè)標(biāo)記間的61kb區(qū)域。經(jīng)RICEGAAS預(yù)測(cè)該區(qū)間有11個(gè)基因，RT-PCR表明該區(qū)間PDIL1-1未表達(dá)。基因組序列測(cè)序表明PDIL1-1從ATG后124bp處開始總共缺失4145bp。功能互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了我們所克隆到的基因PDIL1-1就是控制突變性狀的關(guān)鍵基因。
　　利用半定量RT-PCR和westernblot進(jìn)行組織表達(dá)模式分析，結(jié)果表明

4、PDIL1-1呈現(xiàn)組成性表達(dá)，在根、莖、葉、鞘、穗和胚乳中均有表達(dá)，而且在發(fā)育12天的胚乳中表達(dá)量最高。但是在突變體T3612中，不論是在RNA水平還是蛋白水平均檢測(cè)不到PDIL1-1的表達(dá)。這進(jìn)一步確證粉質(zhì)突變體T3612確實(shí)是PDIL1-1缺失型突變體。
　　我們利用熒光定量RT-PCR的方法，檢測(cè)了31個(gè)淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)情況。與野生型比較，突變體中OsAGPL2、OsPHOL、OsSuSy2和OsSuSy3的表達(dá)增加了

5、將近1倍;另外OsAGPL1、OsAGPL4、OsSSIIb，OsPHOH和OsDPE-1的表達(dá)降低至野生型的一半。利用非變性淀粉膠電泳后活性染色的方法，我們檢測(cè)了突變體發(fā)育9天和12天胚乳中淀粉合成酶（starchsynthase，SS）、淀粉分支酶（branchingenzyme，BE）、淀粉磷酸化酶(StarchPhosphorylase，Pho)和淀粉脫分支酶(debranchingenzyme，DBE)的活性?；钚匀旧Y(jié)果顯示

6、，普魯蘭酶的活性下降，而且突變體普魯蘭酶條帶遷移率下降，ISA的活性沒有明顯差異;SSI的活性顯著上升，而SSIII的活性變化不明顯;Phol的活性顯著下降，Pho2的活性沒有變化;淀粉分支酶的活性均未變化。另外ADPG焦磷酸化酶(AGPase)和蔗糖合酶(SucroseSynthase)的活性顯著增加，UDPG焦磷酸化酶(UGPase)活性變化不大。除此之外，我們利用基于DNA測(cè)序的熒光糖電泳(DSA-FACE)的方法測(cè)定了突變體種子

7、中支鏈淀粉鏈長(zhǎng)分布特征。結(jié)果8≤DP≤13的鏈長(zhǎng)比例增加，6≤DP≤7的鏈長(zhǎng)比例降低。
　　PDIL1-1編碼一個(gè)蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶。體外表達(dá)PDIL1-1重組蛋白并進(jìn)行酶活實(shí)驗(yàn)分析，表明我們克隆到的重組PDIL1-1蛋白可以還原胰島素，而且還原活性與PDIL1-1蛋白的濃度成正比。另外，重組PDIL1-1在體外可以有效地抑制檸檬酸合酶的熱變性，說明其具有分子伴侶活性。
　　PDIL1-1通過對(duì)底物蛋白二硫鍵的氧化還原，可以

8、幫助其形成正確構(gòu)象。熒光定量RT-PCR檢測(cè)分析發(fā)現(xiàn)突變體胚乳細(xì)胞中Bip、Hsp70、Hsp90、CRT、CNX等分子伴侶基因，NEF、ERdj3like、Stt3a和UDPG-glucose-transporteor等輔助分子伴侶基因，bZIP轉(zhuǎn)錄因子基因bZIP60和ERAD降解途徑基因Derlins的表達(dá)量均高于野生型。這些基因受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫（ERstress）所誘導(dǎo)表達(dá)，這說明突變體胚乳細(xì)胞內(nèi)發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫可使細(xì)胞啟