水稻控制花粉管生長基因OsCNGC13的圖位克隆及功能分析和水稻卷葉基因OsZHD1的功能研究.pdf

1、小穗育性是水稻高產(chǎn)的決定因素之一。高且穩(wěn)定的小穗結(jié)實(shí)率是水稻超高產(chǎn)雜交水稻的重要特征。水稻半不育突變體在作物育種、遺傳學(xué)、生殖生物學(xué)和分子生物學(xué)的研究中提供了很好的材料，若能用穩(wěn)定的半不育突變體進(jìn)行研究，闡明半不育產(chǎn)生的分子機(jī)制，對(duì)克服生產(chǎn)中遇到的半不育問題具有重要的借鑒意義。在開花植物受精過程中，花粉管在雌蕊中生長的過程就是其與雌蕊相互識(shí)別的過程，為了更好地理解花粉管和雌蕊的相互作用分子機(jī)制，需要識(shí)別和分離涉及此過程各個(gè)階段的基因，并

2、對(duì)其功能進(jìn)行分析。
　　作為進(jìn)行光合作用的主要器官，葉片對(duì)于種子植物的生長發(fā)育十分重要。在水稻育種中，倒三葉葉片長、窄、薄、直立且適當(dāng)卷曲是超高產(chǎn)雜交水稻的重要特征。其中，葉片適當(dāng)卷曲是突破產(chǎn)量瓶頸的關(guān)鍵，因此，克隆控制卷葉基因并明確其功能具有重大的生產(chǎn)意義。
　　本研究對(duì)一個(gè)新的小穗半不育突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，在水稻受精過程中，OsCNGC13能夠促進(jìn)花粉管通道內(nèi)的細(xì)胞程序性死亡而促進(jìn)花粉管的生長，該結(jié)果為進(jìn)一步闡明水稻生殖

3、發(fā)育的分子機(jī)制提供了新思路。此外，對(duì)一個(gè)新的水稻卷葉突變體進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，OsZIID1在水稻形態(tài)建成尤其是泡狀細(xì)胞的形成和分布中起重要作用，過表達(dá)該基因會(huì)導(dǎo)致植株葉片卷曲，泡狀細(xì)胞數(shù)量增多且排列異常。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.ORF1突變是導(dǎo)致突變體結(jié)實(shí)率下降的主要原因。細(xì)胞學(xué)觀察表明，突變體花器官形態(tài)、花粉粒發(fā)育和體外萌發(fā)均正常;而在花粉管生長和胚囊極核位置方面表現(xiàn)異常。遺傳分析表明，該突變由單顯性基因控制。通過精細(xì)定位將該

4、基因定位在52-kb范圍內(nèi)。基因組測序結(jié)果表明突變體中有44-kb片段發(fā)生了倒置，兩邊的斷口分別在ORF1和ORF3的內(nèi)部，使得ORF1被截短形成NewORF1。3'RACE實(shí)驗(yàn)表明NewORF1與野生型ORF1相比，序列差異表現(xiàn)在C端。通過轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)發(fā)現(xiàn)，野生型中表達(dá)NewORF1會(huì)使植株結(jié)實(shí)率下降;在W109sss1-D中過表達(dá)ORF1，轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實(shí)率有所提高;利用Crispr技術(shù)將野生型中ORF1進(jìn)行基因敲除，全部八個(gè)陽性家系植

5、株的結(jié)實(shí)率都有不同程度的下降。
　　2.ORF1編碼一個(gè)環(huán)核苷酸門控離子通道(cyclic nucleotide-gated channels，CNGCs)蛋白OsCNGC13，該蛋白主要通過調(diào)節(jié)花柱內(nèi)細(xì)胞程序性死亡而控制小穗育性。時(shí)空表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)OsCNGC13呈組成型表達(dá)模式，并在雌蕊中大量累積。水稻和煙草系統(tǒng)表明該蛋白亞細(xì)胞定位于細(xì)胞膜。電生理實(shí)驗(yàn)證明OsCNGC13是一個(gè)鈣離子通道蛋白。水稻中有3個(gè)鈣調(diào)蛋白且均能與OsCN

6、GC13互作，但在水稻16個(gè)CNGC家族成員中并未發(fā)現(xiàn)能與OsCNGC13互作的同源蛋白。利用原子吸收能譜對(duì)開花前后雌蕊中鈣離子相對(duì)含量進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在9311花柱中鈣離子明顯積累，而在突變體中并無此種現(xiàn)象。此外，用阿新藍(lán)染料對(duì)成熟花柱進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)突變體較野生型著色較淺且范圍較小。在開花后30分鐘時(shí)，能觀察到9311花粉管通道中的死亡細(xì)胞，但是突變體中相應(yīng)部位的細(xì)胞依舊完整。開花后兩小時(shí)，能觀察到9311花粉管通道中存在大量細(xì)胞間隙，