水稻控制花粉管生長基因OsCNGC13的圖位克隆及功能分析和水稻卷葉基因OsZHD1的功能研究.pdf

1、小穗育性是水稻高產(chǎn)的決定因素之一。高且穩(wěn)定的小穗結(jié)實率是水稻超高產(chǎn)雜交水稻的重要特征。水稻半不育突變體在作物育種、遺傳學、生殖生物學和分子生物學的研究中提供了很好的材料，若能用穩(wěn)定的半不育突變體進行研究，闡明半不育產(chǎn)生的分子機制，對克服生產(chǎn)中遇到的半不育問題具有重要的借鑒意義。在開花植物受精過程中，花粉管在雌蕊中生長的過程就是其與雌蕊相互識別的過程，為了更好地理解花粉管和雌蕊的相互作用分子機制，需要識別和分離涉及此過程各個階段的基因，并

2、對其功能進行分析。
　　作為進行光合作用的主要器官，葉片對于種子植物的生長發(fā)育十分重要。在水稻育種中，倒三葉葉片長、窄、薄、直立且適當卷曲是超高產(chǎn)雜交水稻的重要特征。其中，葉片適當卷曲是突破產(chǎn)量瓶頸的關(guān)鍵，因此，克隆控制卷葉基因并明確其功能具有重大的生產(chǎn)意義。
　　本研究對一個新的小穗半不育突變體進行研究發(fā)現(xiàn)，在水稻受精過程中，OsCNGC13能夠促進花粉管通道內(nèi)的細胞程序性死亡而促進花粉管的生長，該結(jié)果為進一步闡明水稻生殖

3、發(fā)育的分子機制提供了新思路。此外，對一個新的水稻卷葉突變體進行研究發(fā)現(xiàn)，OsZIID1在水稻形態(tài)建成尤其是泡狀細胞的形成和分布中起重要作用，過表達該基因會導致植株葉片卷曲，泡狀細胞數(shù)量增多且排列異常。本研究主要結(jié)果如下:
　　1.ORF1突變是導致突變體結(jié)實率下降的主要原因。細胞學觀察表明，突變體花器官形態(tài)、花粉粒發(fā)育和體外萌發(fā)均正常;而在花粉管生長和胚囊極核位置方面表現(xiàn)異常。遺傳分析表明，該突變由單顯性基因控制。通過精細定位將該

4、基因定位在52-kb范圍內(nèi)?；蚪M測序結(jié)果表明突變體中有44-kb片段發(fā)生了倒置，兩邊的斷口分別在ORF1和ORF3的內(nèi)部，使得ORF1被截短形成NewORF1。3'RACE實驗表明NewORF1與野生型ORF1相比，序列差異表現(xiàn)在C端。通過轉(zhuǎn)基因互補發(fā)現(xiàn)，野生型中表達NewORF1會使植株結(jié)實率下降;在W109sss1-D中過表達ORF1，轉(zhuǎn)基因植株結(jié)實率有所提高;利用Crispr技術(shù)將野生型中ORF1進行基因敲除，全部八個陽性家系植

5、株的結(jié)實率都有不同程度的下降。
　　2.ORF1編碼一個環(huán)核苷酸門控離子通道(cyclic nucleotide-gated channels，CNGCs)蛋白OsCNGC13，該蛋白主要通過調(diào)節(jié)花柱內(nèi)細胞程序性死亡而控制小穗育性。時空表達分析發(fā)現(xiàn)OsCNGC13呈組成型表達模式，并在雌蕊中大量累積。水稻和煙草系統(tǒng)表明該蛋白亞細胞定位于細胞膜。電生理實驗證明OsCNGC13是一個鈣離子通道蛋白。水稻中有3個鈣調(diào)蛋白且均能與OsCN

6、GC13互作，但在水稻16個CNGC家族成員中并未發(fā)現(xiàn)能與OsCNGC13互作的同源蛋白。利用原子吸收能譜對開花前后雌蕊中鈣離子相對含量進行分析，發(fā)現(xiàn)在9311花柱中鈣離子明顯積累，而在突變體中并無此種現(xiàn)象。此外，用阿新藍染料對成熟花柱進行染色，發(fā)現(xiàn)突變體較野生型著色較淺且范圍較小。在開花后30分鐘時，能觀察到9311花粉管通道中的死亡細胞，但是突變體中相應部位的細胞依舊完整。開花后兩小時，能觀察到9311花粉管通道中存在大量細胞間隙，