水稻葉片早衰基因OsLED的圖位克隆及其功能研究.pdf

1、水稻是中國乃至世界的重要主食之一，糧食產(chǎn)量尤其是水稻的產(chǎn)量將直接關(guān)系到我國糧食安全。
　　葉片是水稻進(jìn)行光合作用的重要器官，其功能葉片的發(fā)育不良或提前衰老直接影響水稻產(chǎn)量及食用價值。研究水稻葉片早衰的分子機理，對了解水稻葉片生長發(fā)育規(guī)律及其衰老進(jìn)程等方面具有重要意義，也將為分子育種奠定一定的理論基礎(chǔ)。本課題組利用60Co輻射誘變秈稻品種93-11,獲得了一個葉片早衰及干旱敏感的隱性突變體osled(oryza sativa lea

2、f early-senescence and drought-sensitive，osled)。本研究利用圖位克隆技術(shù)及其他相關(guān)分子、生理及細(xì)胞學(xué)手段對osled進(jìn)行了初步研究，主要結(jié)果如下:
　　1.突變體osled的主要農(nóng)藝性狀與抗旱性調(diào)查
　　在田間，突變體osled自分蘗期（約4～5片葉齡時）后除心葉及心葉下部的1片完整展開葉外，其他葉片均出現(xiàn)不同程度早衰。與野生型93-11相比，突變體osled表現(xiàn)為生育期更長，植

3、株變矮，穗粒數(shù)、千粒重、結(jié)實率均顯著降低。模擬干旱和自然條件下干旱實驗表明，突變體osled對干旱脅迫更敏感。
　　2.突變體osled的主要生理生化分析與組織化學(xué)染色
　　生理分析表明，野生型劍葉、倒二葉和倒三葉的丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性及過氧化物酶(POD)活性基本不變，但突變體則顯著升高且倒二葉和倒三葉極顯著高于野生型;突變體和野生型三片葉的可溶性蛋白含量、過氧化氫酶(CAT)活性及葉綠素總含

4、量均依次下降，但突變體倒二葉和倒三葉的含量或活性均顯著低于野生型。組織化學(xué)染色表明，osled葉片細(xì)胞膜系統(tǒng)已不完整或細(xì)胞死亡;細(xì)胞內(nèi)存在O2-和H2O2的積累。
　　3.OsLED響應(yīng)生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控突變體植株生長
　　研究表明，JA、SA和H2O2抑制突變體osled植株生長發(fā)育。經(jīng)1.0mMSA處理之后，osled根長下降56.3％，株高下降63.9％;經(jīng)1.5mMSA處理之后，osled根長下降77.1％，株高下降63

5、.9％。經(jīng)12.5μMJA處理，osled株高下降64.6％;20μMJA處理之后，株高下降91.2％;雙氧水處理之后，osled株高下降93.9％。
　　4.自然生長條件下osled葉片的掃描電鏡和激素處理后掃描電鏡分析
　　與野生型93-11相比，掃描電鏡結(jié)果顯示突變體osled葉片刺毛極顯著增多。表現(xiàn)在大刺毛(macro hair)，小刺毛(micro hair)密度增加，數(shù)量增多。多效唑（80mMpaclobutra

6、zol）極顯著抑制osled葉片上表皮刺毛發(fā)育;經(jīng)1.5mMSA處理后，osled葉片上表皮大刺毛(Macro hair)數(shù)量降低28.6％，小刺毛(microhair)數(shù)量增高18.6％;而經(jīng)20.0μMJA處理的osled植株，葉片上表皮大刺毛和小刺毛的數(shù)量均顯著增加。
　　5.OsLED的基因定位及候選基因的確定
　　突變體osled受到一個隱性基因調(diào)控，利用圖位克隆技術(shù)將該基因定位在水稻第三染色體長臂上164Kb物理

7、范圍內(nèi)。候選基因的篩選及基因組測序發(fā)現(xiàn)，位于該區(qū)間內(nèi)的一個注釋基因AK111569(LSD1相關(guān)基因)發(fā)生兩個堿基(AA)缺失，造成移碼突變。對定位群體F2中的正常植株與早衰植株進(jìn)行重測序，比對結(jié)果進(jìn)一步證實該基因發(fā)生突變。
　　6.轉(zhuǎn)基因植株的表型分析
　　本課題組構(gòu)建了pTCK03-RNAi-OsLED載體和互補載體pC1300-OsLED，經(jīng)過遺傳轉(zhuǎn)化實驗，獲得了相應(yīng)的轉(zhuǎn)基因株系。與突變體osled相比，RNAi轉(zhuǎn)基因