水稻葉色白化基因BH6的圖位克隆.pdf

1、水稻是世界上最主要的糧食作物之一，同時(shí)也是禾本科重要模式作物，具有重要的實(shí)用和科研價(jià)值。水稻葉片是光合作用的主要場所，也是理想株型的關(guān)鍵構(gòu)成因素，對葉色相關(guān)基因進(jìn)行克隆和功能分析既可以用于研究光合作用的生理生化機(jī)制，又可用來進(jìn)行高光效育種以提高水稻產(chǎn)量。氨酰tRNA合成酶是參與催化蛋白合成過程并確保mRNA的遺傳信息準(zhǔn)確無誤翻譯咸蛋白質(zhì)序列的一類關(guān)鍵酶，此外，氨酰tRNA合成酶還具有參與基因表達(dá)的調(diào)控和rRNA合成等重要作用。目前，關(guān)于

2、氨酰tRNA合成酶是如何參與葉綠素合成以及影響光合作用的機(jī)制尚未明確。本研究以一個(gè)葉色白化致死突變體（bai hua6, bh6為材料，通過圖位克隆方法確定BH6基因編碼一類氨酰tRNA合成酶，經(jīng)過對bh6的表型觀察和該基因的功能分析，我們得到了以下結(jié)果:
　　1.本文的白化致死突變體bh6為粳稻品種寧粳4號的化學(xué)誘變所得，經(jīng)過大田播種生長、培養(yǎng)箱培養(yǎng)后移栽至大田，以及在光照培養(yǎng)箱持續(xù)培養(yǎng)生長，我們發(fā)現(xiàn)該突變體葉片始終保持穩(wěn)定的白

3、化，后期葉色不能轉(zhuǎn)綠最終致死，并且該表型不隨外界溫度的變化而改變。葉綠素含量測定和葉綠素自發(fā)熒光觀察都證明了該突變體與野生型存在明顯的葉綠素含量差異。
　　2.通過電子透射顯微鏡觀察了野生型和突變體葉片細(xì)胞中葉綠體的超微形態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型相比，突變體中的葉綠體存在明顯的結(jié)構(gòu)缺陷，表現(xiàn)為類囊體結(jié)構(gòu)的異常，并伴隨著嗜鋨顆粒的增加，最終導(dǎo)致其光舍能力的喪失。
　　3.對BH6基因進(jìn)行了遺傳分析，結(jié)果表明雜合基因的植株后代正

4、常與白化單株分離比符合3∶1，該基因是隱性單基因控制的，隨后用雜合單株為母本，秈稻品種N22為父本雜交構(gòu)建F2群體來精細(xì)定位BH6基因，利用F2群體中的318個(gè)白化極端個(gè)體將該基因精細(xì)定位在到第六號染色體頂端到分子標(biāo)記Bh6-12之間物理距離為266 kb的區(qū)間內(nèi)。通過網(wǎng)站RiceXPro預(yù)測定位區(qū)間內(nèi)的基因，根據(jù)注釋初步判定ORF4與ORF15與葉綠體相關(guān)，通過測序發(fā)現(xiàn)候選基因ORF15(Os06g0103600)的第六個(gè)外顯子中發(fā)生

5、了單堿基突變，ORF15可能就是白化表型的候選基因。隨后利用CRISPR技術(shù)對野生型ORF15基因進(jìn)行敲除實(shí)驗(yàn)，獲得的陽性轉(zhuǎn)基因植株也表現(xiàn)出bh6突變體相似的白化表型，表明Os06g010600的突變就是導(dǎo)致bh6突變體呈現(xiàn)白化的原因。
　　4.通過網(wǎng)站上對該基因表達(dá)蛋白的序列分析比較，發(fā)現(xiàn)該基因編碼一個(gè)甘氨酰 tRNA合成酶，這種酶包含四個(gè)結(jié)構(gòu)域，而發(fā)生突變的位點(diǎn)位于其中各物種間最為保守的α核心結(jié)構(gòu)域，該基因的突變很可能導(dǎo)致α核

6、心結(jié)構(gòu)域中的活性位點(diǎn)的改變導(dǎo)致酶活性的喪失，進(jìn)化樹分析表明該基因編碼的這一類蛋白廣泛存在于高等植物中，并且同源性較高，證明了該基因在進(jìn)化中具有高度的保守性。
　　5.通過熒光定量RT-PCR分析，檢測了整個(gè)葉綠體發(fā)育互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中各基因在bh6突變體中的表達(dá)水平的變化情況，包括葉綠體發(fā)育相關(guān)基因和葉綠素合成代謝相關(guān)基因的定量分析，結(jié)果表明與野生型相比，由于該基因的突變導(dǎo)致整個(gè)互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的基因表達(dá)在突變體中都受到了一定影響。