家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因的表達(dá)特點(diǎn)及功能分析.pdf

1、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)是一種與細(xì)胞周期相關(guān)的核蛋白，從酵母到人類(lèi)等真核生物中都具有廣泛作用。Cyclins周期性積累與分解對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程起關(guān)鍵作用。Cyclins通過(guò)依次激活相應(yīng)的細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性激酶(Cyclindependent kinase，CDK)，多層次有序調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。Cyclins還決定CDK底物的磷酸化，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期的各時(shí)相或檢測(cè)點(diǎn)，推動(dòng)細(xì)胞周期的進(jìn)程。在細(xì)胞的增殖、分化及腫瘤發(fā)生中起重要作用。
　

2、　 在家蠶(Bombyx mori)中共發(fā)現(xiàn)5種細(xì)胞周期蛋白，即CyclinA、B、B3、L1、E。本研究以家蠶為研究對(duì)象，對(duì)家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因的表達(dá)特點(diǎn)及Cyclin E基因的功能進(jìn)行了分析，獲得的主要結(jié)果如下：
　　 1、家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因的克隆及結(jié)構(gòu)特征與表達(dá)分析
　　 利用家蠶基因組數(shù)據(jù)庫(kù)信息設(shè)計(jì)引物，分析Cyclins在家蠶中的表達(dá)情況。分別克隆了5個(gè)基因，對(duì)基因序列結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果表明，Cycli

3、n A、B、B3基因分別有7個(gè)外顯子，Cyclin E基因有8個(gè)外顯子，Cyclin L1基因只有1個(gè)外顯子。CyclinA及CyclinE基因存在較多的剪切方式，CyclinA基因主要包含大小為2141bp和2173 bp的2種轉(zhuǎn)錄本，其變化在第7個(gè)外顯子，CyclinE基因則含有1422 bp、1290 bp及1194 bp等6個(gè)大小不同的序列，變化集中于第5～7外顯子，而CyclinB、B3、L1基因則相對(duì)穩(wěn)定。對(duì)蛋白序列進(jìn)行分析

4、表明，這5種周期蛋白都具有典型的周期蛋白盒序列，CyclinA、B、B3、L1都有2個(gè)連續(xù)的周期蛋白盒，CyclinE只有1個(gè)周期蛋白盒。Cyclins家族基因的表達(dá)存在組織特異性，CyclinA基因只在精巢中表達(dá)，CyclinB3基因只在精巢和卵巢中有明顯的表達(dá)，CyclinE基因在絲腺、腦、脂肪體、中腸、馬氏管、精巢、卵巢及血液8種組織都有表達(dá)，CyclinB和CyclinLl基因在除絲腺或血液外的其他7種組織檢測(cè)到表達(dá)。研究結(jié)果為

5、進(jìn)一步探究細(xì)胞周期蛋白在昆蟲(chóng)蛻皮、變態(tài)等生理過(guò)程中的功能提供了參考。
　　 2、家蠶CyclinE基因在5齡幼蟲(chóng)組織表達(dá)的剪切變體和表達(dá)特征
　　 為研究CyclinE基因在家蠶不同組織中的表達(dá)情況，克隆了家蠶CyclinE基因在5齡幼蟲(chóng)不同組織表達(dá)的cDNA序列，在不同組織中獲得該基因的6種不同剪切變體，這6種剪切變體前4個(gè)外顯子和最后一個(gè)外顯子都相同，變化主要集中在5～7外顯子處。這些結(jié)果提示，不同組織中表達(dá)的Cyc

6、linE基因剪切體不同，可能與特殊的細(xì)胞周期類(lèi)型或者特定的細(xì)胞周期階段有關(guān)，多樣而獨(dú)特的CyclinE-CDK2復(fù)合物可能調(diào)節(jié)不同組織在特定發(fā)育中的細(xì)胞周期進(jìn)程。同源性比較顯示，不同物種來(lái)源的CyclinE周期蛋白盒具有較高的保守性，有35個(gè)氨基酸為共同保守序列。利用實(shí)時(shí)定量PCR分析顯示，CyclinE基因在家蠶5齡第3天各組織中均有表達(dá)，并且在脂肪體中的表達(dá)相對(duì)較高。研究結(jié)果可為進(jìn)一步探討家蠶CyclinE基因在家蠶生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的

7、生物學(xué)功能提供參考。
　　 3、家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因在5齡3天幼蟲(chóng)組織中的表達(dá)
　　 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)了家蠶細(xì)胞周期蛋白家族基因在5齡3天幼蟲(chóng)組織中的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示，在絲腺中，CyclinE基因大量表達(dá)，CyclinA、L1基因表達(dá)較弱，而CyclinB、B3基因沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)。家蠶絲腺細(xì)胞屬于核內(nèi)有絲分裂細(xì)胞，在G1期和S期之間不斷轉(zhuǎn)換，其間不經(jīng)過(guò)G2期和M期的轉(zhuǎn)換。此結(jié)果表明，CyclinE基因

8、在絲腺細(xì)胞中G1/S期起重要作用。而CyclinB、B3基因在G2/M期起作用。同時(shí)也檢測(cè)了其他幾種組織中CyclinA、B、B3、L1基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，CyclinA、B、B3、L1基因都在精巢中高表達(dá)，推測(cè)這幾個(gè)基因在家蠶精巢中的精母細(xì)胞發(fā)育形成精子進(jìn)行分裂時(shí)起著重要作用。
　　 4、CyclinE基因干擾RNA對(duì)家蠶細(xì)胞增殖的影響
　　 為了研究siRNA抑制家蠶CyclinE基因表達(dá)后，對(duì)BmN細(xì)胞增殖及

9、細(xì)胞周期的影響。化學(xué)合成針對(duì)CyclinE基因的干擾RNA小片段，通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞，應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定siRNA干擾后CyclinE mRNA水平，流式細(xì)胞儀檢測(cè)siRNA干擾后的細(xì)胞周期分布。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染siRNA后，siRNA-1252(針對(duì)1252nt開(kāi)始的mRNA序列)和siRNA-568分別使BmN細(xì)胞CyclinE mRNA水平降低了68％和90％；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，G0/G1期細(xì)胞比率增多，S

10、期和G2/M期細(xì)胞比率減少。結(jié)果表明，在家蠶BmN細(xì)胞中導(dǎo)入siRNA有效地抑制CyclinE基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞增殖減緩。驗(yàn)證了CyclinE基因在細(xì)胞周期的G1/S期起重要作用。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)針對(duì)CyclinE基因不同部位設(shè)計(jì)的siRNA，下調(diào)CyclinE基因的效果不同，568位點(diǎn)比1252位點(diǎn)干擾效果顯著，推測(cè)siRNA的基因沉默效果除了嚴(yán)格遵從編碼堿基的選擇設(shè)計(jì)原則外，可能還與基因編碼區(qū)域的選擇靶點(diǎn)相關(guān)。
　　 5、外源物質(zhì)

11、對(duì)家蠶BmN細(xì)胞周期蛋白家族基因轉(zhuǎn)錄水平的影響
　　 為了研究家蠶BmN細(xì)胞周期蛋白家族基因在受到外源物質(zhì)影響下的表達(dá)變化，本文選取了BmNPV和蛹蟲(chóng)草水提取液作為刺激物，添加到家蠶BmN培養(yǎng)基中，利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)BmN細(xì)胞周期蛋白家族基因在轉(zhuǎn)錄水平上的變化。結(jié)果顯示，在BmNPV感染0～12h時(shí)，Cyclin家族各基因表達(dá)水平都明顯下降，CyclinB3和CyclinA基因表達(dá)量降到最低點(diǎn)。在12～24 h，Cycl

12、inB和CyclinL1基因表達(dá)量顯著下降，CyclinE基因表達(dá)變化平緩，并且CyclinB基因表達(dá)量下降到最低值，在24～36h，CyclinE和CyclinL1基因表達(dá)量下降到最低值。36 h以后，Cyclin家族各基因表達(dá)量變化平緩，沒(méi)有顯著變化。結(jié)果表明，家蠶BmN細(xì)胞周期蛋白家族基因的表達(dá)水平受BmNPV DNA復(fù)制的影響，在不同感染時(shí)期，對(duì)BmN細(xì)胞周期蛋白家族不同基因抑制的效果不同。同時(shí)在本研究中采用冷凍真空結(jié)合輻射滅菌

13、的方法制備的蛹蟲(chóng)草水提取液，對(duì)BmN細(xì)胞具有很好的抑制作用，濃度越高對(duì)BmN的抑制效果越明顯，同一濃度作用時(shí)間越長(zhǎng)抑制作用也越顯著。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步闡明家蠶BmN細(xì)胞受到蟲(chóng)草水提取液抑制后，Cyclin家族基因的表達(dá)變化。在添加1 mg/mL的蛹蟲(chóng)草水提取液后24 h，CyclinA、B、B3、L1基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)量即下降，其中CyclinB3基因表達(dá)量下降明顯，為對(duì)照的35.14％，48 h各基因都下降至對(duì)照區(qū)的10％左右，72 h以后轉(zhuǎn)