煙草細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶NtCDK8基因的克隆及功能分析.pdf

1、自然界的任何物種，都彌足珍貴。而植物更是與人類的生活息息相關(guān)。藻類通過(guò)光合作用所釋放的氧氣，是生命進(jìn)化的基礎(chǔ);起源于美索不達(dá)米亞的小麥，墨西哥的玉米，中國(guó)浙江的水稻幾千年來(lái)一直見(jiàn)證著、支撐著人類的成長(zhǎng)。植物的重要價(jià)值及其存在意義自不言而喻。植物細(xì)胞的的分裂分化最終導(dǎo)致了完整的植株，因此從微觀上研究植物細(xì)胞的分裂分化過(guò)程，對(duì)于改造植物的個(gè)體性狀是一致的。
　　CDK(cyclin-dependent kinase)是在上世紀(jì)八十年代

2、從酵母中發(fā)現(xiàn)的。近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞周期的調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。但一直以來(lái)植物中的CDK研究的并不多。本文通過(guò)對(duì)煙草的CDK家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析及對(duì)其E類亞家族基因CDK8進(jìn)行克隆、轉(zhuǎn)基因研究，為煙草及其他植物的細(xì)胞周期調(diào)控研究奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。本研究獲得了主要結(jié)果如下:
　　1、通過(guò)同源序列比對(duì)及進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)煙草中的CDK和其他物種一樣可以劃分為A、B、C、D、E、F、G有功能報(bào)道的七類及有一些預(yù)測(cè)功能或結(jié)構(gòu)相似的C

3、DK-Like類。其中NtCDKA有四個(gè)，NtCDKB有兩個(gè)，NtCDKC有兩個(gè)，NtCDKD/E/F/G分別有一個(gè)，NtCDK-Like有12個(gè)，即本研究鑒定發(fā)現(xiàn)煙草中共有24個(gè)CDK基因。且通過(guò)多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，每一個(gè)亞家族基因都具有極其保守其相對(duì)特異的Cyclin結(jié)合域。
　　2、為了探索細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶(CDK)在煙草中的生物學(xué)功能，通過(guò)同源性搜索的方法獲得了煙草細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因的EST序列。采用RT-PCR

4、技術(shù)，從煙草栽培品種紅花大金元中成功克隆出了細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶基因，并命名為NtCDK8。NtCDK8基因cDNA編碼區(qū)全長(zhǎng)為1422bp，編碼473個(gè)氨基酸。生物信息學(xué)同源性比對(duì)分析:NtCDK8與擬南芥、苜蓿的CDK8具有較高的同源性，且編碼的蛋白質(zhì)具有相同的結(jié)構(gòu)特征;蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析:NtCDK8具有Serine/Threonine蛋白激酶結(jié)構(gòu)域，可以通過(guò)促使下游蛋白中的絲氨酸蘇氨酸殘基磷酸化，從而促使細(xì)胞外信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)傳遞;

5、通過(guò)疏水性、信號(hào)肽及亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)綜合分析表明，蛋白NtCDK8可能是一個(gè)在細(xì)胞核中發(fā)揮功能的親水性蛋白。表達(dá)模式分析結(jié)果顯示NtCDK8在干旱、鹽脅迫、低溫處理下表達(dá)量有很大變化，表明NtCDK8參與了環(huán)境信號(hào)的調(diào)控;激素處理分析表明，煙草在受到生長(zhǎng)素、脫落酸等外源激素處理后，其NtCDK8表達(dá)水平變化很大，表明NtCDK8很可能參與了煙草細(xì)胞的分裂分化過(guò)程;同時(shí)表達(dá)譜分析NtCDK8的表達(dá)具有組織特異性。亞細(xì)胞定位的結(jié)果表明NtCD

6、K8大部分存在于細(xì)胞核內(nèi)，這一結(jié)果是和其細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的性質(zhì)是一致的，也和生物信息學(xué)的分析結(jié)果相同。
　　為了更進(jìn)一步的解釋NtCDK8的生物學(xué)功能，本研究同時(shí)進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)。目前已獲得了通過(guò)PCR鑒定、蛋白實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)的轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)病原菌PstDC3000的接菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明NtCDK8轉(zhuǎn)基因植株的抗PstDC3000的能力發(fā)生了穩(wěn)定的變化。說(shuō)明NtCDK8參與到了機(jī)體免疫的過(guò)程。顯微觀察發(fā)現(xiàn)NtCDK8轉(zhuǎn)基因植株的葉