通過(guò)抑制細(xì)胞周期依賴性激酶9的活性治療創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究.pdf

1、創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎是關(guān)節(jié)外傷后的常見(jiàn)并發(fā)癥。關(guān)節(jié)創(chuàng)傷涉及到關(guān)節(jié)軟骨，軟骨下骨，韌帶，半月板以及關(guān)節(jié)周圍軟組織等部位損傷。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，約20％的膝關(guān)節(jié)創(chuàng)傷病例在10～20年之后進(jìn)展成為骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis)。在軟骨損傷后極早期，各種前炎癥因子（Pro-inflammatory cytokine）如白細(xì)胞介素-1(interleukin-1β，IL-1β)、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α，TNFα

2、)或脂多糖(LPS)等刺激軟骨細(xì)胞通過(guò)一系列的免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活下游各種分解代謝基因，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMPs）和蛋白聚糖酶(Aggrecanase)的表達(dá)。在人體軟骨組織中，MMPs和Aggrecanase的異常表達(dá)會(huì)降解破壞軟骨基質(zhì)，由此損傷軟骨基質(zhì)的完整性、降低基質(zhì)的水合含量等，導(dǎo)致軟骨組織的損傷老化，引起疼痛，活動(dòng)障礙甚至關(guān)節(jié)畸形等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。但目前臨床上對(duì)于

3、骨關(guān)節(jié)炎的治療多關(guān)注于關(guān)節(jié)炎晚期止痛或手術(shù)治療;而對(duì)于創(chuàng)傷后軟骨損傷的極早期則很少進(jìn)行干預(yù)，從而失去了預(yù)防與治療法的最佳時(shí)機(jī)。
　　各種前炎因子及其下游反應(yīng)基因的快速激活表達(dá)，在創(chuàng)傷性軟骨損傷的機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。最新的基因轉(zhuǎn)錄研究顯示，在各種快速反應(yīng)基因表達(dá)過(guò)程中，轉(zhuǎn)錄聚合酶Ⅱ(polymeraseⅡ，PolⅡ)在基因轉(zhuǎn)錄起始之前便已經(jīng)結(jié)合到基因啟動(dòng)子上，并且啟動(dòng)了基因的轉(zhuǎn)錄，這為各種應(yīng)激表達(dá)基因的快速反應(yīng)打下了基礎(chǔ)。隨后基因

4、轉(zhuǎn)錄在延長(zhǎng)階段以前會(huì)有一個(gè)暫停，需要正向轉(zhuǎn)錄因子b（Positive transcription elongation factor b，p-TEFb）的刺激才能繼續(xù)基因轉(zhuǎn)錄的延長(zhǎng)階段。細(xì)胞周期依賴性激酶-9（cyclic dependent kinase-9， CDK-9）是p-TEFb的主要組成部分，在外界炎癥信號(hào)的刺激下使p-TEFb與PolⅡ結(jié)合，開始基因轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)。因此CDK9協(xié)助p-TEFb與PolⅡ結(jié)合的過(guò)程是基因轉(zhuǎn)錄延長(zhǎng)階

5、段的限速步驟。研究顯示使用Flavopiridol對(duì)P-TEFb的主要組成部分CDK-9的抑制能有效的降低基因轉(zhuǎn)錄的效率，達(dá)到抑制基因表達(dá)的作用。
　　本研究的興趣在于在軟骨損傷后極早期使用藥物抑制CDK9的活性，在細(xì)胞培養(yǎng)，組織塊培養(yǎng)和動(dòng)物在體實(shí)驗(yàn)3個(gè)層次觀察：(1)抑制CDK9的活性是否能抑制各種炎癥因子及其下游效應(yīng)基因的表達(dá);(2)抑制CDK9的活性是否能對(duì)軟骨細(xì)胞或軟骨組織塊起到保護(hù)作用;(3)抑制CDK9的活性是否能延緩

6、創(chuàng)傷后骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。
　　目的：
　　在軟骨損傷后的極早期對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行干預(yù)，探索治療或者延緩創(chuàng)傷性骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的新策略。
　　方法：
　　1.獲取人膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予不同的炎癥刺激(IL-1β，TNFα與LPS)，伴隨或不伴隨CDK9抑制劑處理。收集細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)，蛋白合成和軟骨細(xì)胞活性檢測(cè);
　　2.獲取牛新鮮后腿膝關(guān)節(jié)整體標(biāo)本，從中分離軟骨組織塊，對(duì)其進(jìn)行控制下機(jī)械壓應(yīng)力損

7、傷造模。造模成功后分組行組織塊培養(yǎng)，伴隨或不伴隨CDK9抑制劑處理，收集標(biāo)本行基因表達(dá)，蛋白合成，軟骨細(xì)胞活性和組織塊生物力學(xué)性質(zhì)檢測(cè);
　　3.對(duì)C57BL/6小鼠行右下肢前交叉韌帶損傷造模，造模成功后按實(shí)驗(yàn)預(yù)設(shè)給予腹腔內(nèi)CDK9抑制劑注射。獲取膝關(guān)節(jié)標(biāo)本行基因表達(dá)，蛋白活性，骨量以及組織學(xué)等檢測(cè)
　　結(jié)果：
　　1.CDK9活性抑制在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)體系中的作用
　　1.1抑制CDK9活性可以抑制外界炎癥因子對(duì)軟

8、骨細(xì)胞的刺激作用
　　基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果顯示，用IL-1β，TNFα或者LPS對(duì)軟骨細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行刺激，可以顯著地提高首要反應(yīng)基因iNOS的表達(dá);同時(shí)也激發(fā)了炎癥下游效應(yīng)基因，如MMPs，ADAMTSs的表達(dá)。使用藥物抑制CDK9的活性5小時(shí)，可以完全抑制炎癥刺激后極早期iNOS與炎癥下游效應(yīng)基因的表達(dá)。蛋白印記檢測(cè)結(jié)果顯示抑制CDK9的活性可以減少M(fèi)MP13蛋白的合成。
　　1.2抑制CDK9活性對(duì)健康軟骨細(xì)胞無(wú)損傷作用

9、>　　抑制軟骨細(xì)胞CDK9活性5小時(shí)以后，軟骨細(xì)胞的存活率與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;軟骨基質(zhì)組成成分（Aggrecan，Col2a1）與對(duì)照組相比差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.抑制CDK9的活性保護(hù)軟骨組織塊避免機(jī)械性壓應(yīng)力后炎癥反應(yīng)的損傷
　　2.1抑制CDK9活性可以減少軟骨組織塊機(jī)械損傷后的炎癥反應(yīng)
　　對(duì)軟骨組織塊施加瞬間30％應(yīng)力的機(jī)械損傷，可以顯著增加前炎癥因子如IL-1β和TNFα的表達(dá)，同時(shí)也顯著

10、增加軟骨基質(zhì)分解酶如MMPs和ADAMTSs的表達(dá)。使用藥物抑制CDK9活性5小時(shí)，可以顯著抑制機(jī)械損傷后軟骨塊中前炎癥因子與軟骨基質(zhì)分解酶的表達(dá)。
　　2.2抑制CDK9活性可以減少機(jī)械損傷后軟骨細(xì)胞的死亡
　　30％應(yīng)力的機(jī)械損傷，可以顯著增加軟骨細(xì)胞的死亡，差異與對(duì)照組相比有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。使用藥物抑制CDK9活性，可以顯著減少損傷后軟骨細(xì)胞的死亡數(shù)，軟骨細(xì)胞存活率與對(duì)照組差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.3抑制C

11、DK9活性可以在機(jī)械損傷后減少軟骨塊基質(zhì)的分解
　　機(jī)械損傷可以顯著增加軟骨組織塊中GAG的分解;機(jī)械應(yīng)力破壞了軟骨基質(zhì)，降低了軟骨組織塊的硬度，改變了軟骨塊的力學(xué)特性。抑制CDK9的活性，可以減少損傷后軟骨組織塊中GAG的分解，保持軟骨基質(zhì)完整，并且保存軟骨組織塊的生物力學(xué)性質(zhì)。
　　3.體內(nèi)抑制CDK9的活性可以減輕小鼠膝關(guān)節(jié)損傷后早期局部的炎癥反應(yīng)，延緩小鼠模型骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生
　　3.1抑制CDK9活性減少小鼠膝

12、關(guān)節(jié)損傷局部早期前炎癥因子及其下游效應(yīng)基因的表達(dá)
　　小鼠膝關(guān)節(jié)損傷后極早期，即2個(gè)小時(shí)后傷側(cè)膝關(guān)節(jié)局部前炎癥因子如IL-1β，IL-6的表達(dá)顯著增加，4個(gè)小時(shí)時(shí)出現(xiàn)表達(dá)量最高值;各種下游基因如MMPs，ADAMTSs等均出現(xiàn)表達(dá)量增加。使用CDK9抑制劑腹腔注射后，傷后局部前炎癥因子與下游效應(yīng)基因的表達(dá)均被顯著抑制，未見(jiàn)明顯表達(dá)上抬和高峰。直到傷后7天，目的基因的表達(dá)均沒(méi)有提高。
　　3.2抑制CDK9活性能夠減少膝關(guān)節(jié)損

13、傷后軟骨下骨量丟失
　　對(duì)小鼠傷側(cè)膝關(guān)節(jié)行Micro-CT掃描結(jié)果顯示，傷后早期即有大量的軟骨下骨量丟失，在傷后第七天出現(xiàn)骨量最低值;而后骨量有所恢復(fù)，約2周后達(dá)到與傷前相當(dāng)?shù)乃?。腹腔注射CDK9抑制劑可以明顯減少傷側(cè)膝關(guān)節(jié)的軟骨下骨量丟失。在傷后第三天能夠保持損傷組與對(duì)照組的骨量相當(dāng);且直到傷后第7天均沒(méi)有出現(xiàn)骨量明顯丟失。
　　3.3抑制CDK9活性減少局部炎性組織的侵潤(rùn)
　　小鼠膝關(guān)節(jié)標(biāo)本石蠟切片組織學(xué)染色結(jié)果

14、顯示，傷后第三天局部即有明顯的巨核細(xì)胞侵潤(rùn)，軟組織纖維化以及血管翳形成;直到傷后第七天，組織學(xué)變化呈惡化進(jìn)展。腹腔注射CDK9抑制劑明顯遏制巨核細(xì)胞，軟組織纖維化和血管翳的形成。
　　結(jié)論：
　　1.在體外細(xì)胞培養(yǎng)中，抑制軟骨細(xì)胞CDK9可以顯著減弱IL-1β，TNFα與LPS等多條炎癥信號(hào)通路的傳導(dǎo)，并降低下游各種基質(zhì)分解基因的表達(dá)。且軟骨細(xì)胞CDK9活性的抑制不具細(xì)胞毒性并不會(huì)影響軟骨細(xì)胞的存活率和合成代謝能力;

15、　　2.在體外軟骨組織塊培養(yǎng)中，抑制CDK9能遏制軟骨組織塊機(jī)械損傷后的炎癥反應(yīng);減輕軟骨細(xì)胞的凋亡，提高細(xì)胞的存活率;減少軟骨基質(zhì)的分解;從而維持了軟骨組織塊的力學(xué)特性。且抑制CDK9同樣沒(méi)有明顯的軟骨細(xì)胞毒性;
　　3.在小鼠骨關(guān)節(jié)炎的模型中抑制CDK9能遏制損傷關(guān)節(jié)局部前炎癥因子IL-1β，IL-6與TNFα及其下游效應(yīng)基因MMPs，ADAMTS的表達(dá)，保存軟骨下骨量，減少局部炎癥組織的浸潤(rùn)。在傷后早期能有效地延緩和減輕創(chuàng)傷