細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶2新型非肽類別構(gòu)抑制劑的篩選及生物活性研究.pdf

1、背景:細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程，分為間期和分裂期兩個(gè)階段。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要組成部分，細(xì)胞的增殖、分化、衰老和凋亡也都是細(xì)胞周期依賴性的。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期亢進(jìn)和細(xì)胞凋亡通路受損可共同導(dǎo)致細(xì)胞的癌變和腫瘤的發(fā)生，因此，腫瘤也被認(rèn)為是一種細(xì)胞周期疾病，是當(dāng)今嚴(yán)重威脅人類健康的重大惡性疾病之一。因此，研制針對細(xì)胞周期的具有靶向性的抗癌藥物一直是近幾十年來的研究熱點(diǎn)。癌細(xì)胞的主要特點(diǎn)包括細(xì)胞凋

2、亡通路調(diào)節(jié)機(jī)制的失控和細(xì)胞的異常遷移。研究表明，哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinases，CDKs)參與調(diào)控細(xì)胞周期每個(gè)環(huán)節(jié)的起始和進(jìn)程，是細(xì)胞周期調(diào)控的核心。CDK2是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的CDKs家族成員中研究較為深入的周期調(diào)控因子之一，它與細(xì)胞周期蛋白E(cyclin E)和A(cyclin A)相互作用從而導(dǎo)致細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期[1]。研究顯示，在腫瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)CDK2的表達(dá)異常增多，這也是腫瘤

3、細(xì)胞重要的生物學(xué)特征之一。因此，CDK2已經(jīng)成為治療癌癥的重要靶標(biāo)。隨著對CDK2晶體結(jié)構(gòu)不斷的研究認(rèn)識，近年來已陸續(xù)報(bào)道了越來越多的ATP競爭性CDK2小分子抑制劑，已有多種有效藥物獲批進(jìn)入臨床研究階段，但這些ATP競爭性小分子抑制劑的開發(fā)應(yīng)用卻面臨著選擇性差的巨大難題[2]。別構(gòu)調(diào)節(jié)則是指某種不直接涉及蛋白質(zhì)活性的物質(zhì)，通過與蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)以外的其他位點(diǎn)（別構(gòu)位點(diǎn)）相結(jié)合，從而引起蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象變化并引起蛋白質(zhì)活性改變的現(xiàn)象。別構(gòu)

4、調(diào)節(jié)劑的作用方式與傳統(tǒng)藥物（靶向于正性結(jié)合位點(diǎn)）相比具有許多明顯的優(yōu)勢[3-9]:(1)對靶標(biāo)呈現(xiàn)更高的選擇性;(2)較少的不良反應(yīng);(3)低毒性等。因此，以別構(gòu)調(diào)節(jié)劑為研究方向進(jìn)行定向篩選和結(jié)構(gòu)改造，有望為相關(guān)疾病的治療另辟蹊徑。
　　目的:根據(jù)p-CDK2-cyclin A3的晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:2CCI)，在CDK2與cyclin A3相互作用界面附近的口袋處，擬篩選出CDK2新型非肽類別構(gòu)抑制劑的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)。

5、　　方法:本論文以p-CDK2-cyclin A3的晶體結(jié)構(gòu)(PDB code:2CCI)為靶標(biāo)，綜合運(yùn)用分子對接、虛擬篩選的方法，結(jié)合體外生物活性測試，并進(jìn)行了對接模型驗(yàn)證和非競爭性驗(yàn)證，同時(shí)應(yīng)用GST pull-down技術(shù)初步探討了小分子的別構(gòu)作用機(jī)制。
　　結(jié)果:(1)初篩獲得了I4和I9兩個(gè)化合物具有較強(qiáng)的p-CDK2-cyclin A3抑制活性，I4和I9對p-CDK2-cyclin A3的IC50值分別為13.59μ

6、M，52.12μM;(2)在不同ATP和底物濃度下，I4和I9對p-CDK2-cyclin A3的IC50值并未有顯著改變，仍然具有明顯的p-CDK2-cyclin A3抑制活性;(3)I4對p-R150A-cyclin A3的IC50值為330.2μM，對p-Y180A-cyclin A3的IC50值為316.1μM，是野生型的23-24倍，抑制活性明顯降低;I9對p-R150A-cyclin A3的IC50值為884.7μM，對p-

7、Y180A-cyclin A3的IC50值為151.4μM，抑制活性同樣明顯降低;(4)I4和I9均可抑制人源肺癌細(xì)胞A549、肝癌細(xì)胞HepG2和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的增殖，I4對A549、HepG2和MDA-MB-231的IC50值分別為49.04μM，36.44μM，43.27μM，I9對A549、 HepG2和MDA-MB-231的IC50值分別為85.24μM，299.7μM，460.4μM;(5)100μM時(shí)，I4

8、有效地阻滯HepG2細(xì)胞周期在S期，S期細(xì)胞的百分含量從對照組的17.67％增加到藥物作用組(100μM)的28.25％，當(dāng)I4的作用濃度增加到200μM時(shí)，進(jìn)入G2期的HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)出減少的趨勢;I9在低濃度下(10-50μM)微弱地阻滯A549細(xì)胞周期在S期，當(dāng)I9的作用濃度增加到200μM時(shí)，則有效地阻滯A549細(xì)胞周期在S期，S期細(xì)胞的百分含量從對照組的11.53％增加到的41.30％;(6)GST-CDK2能夠與His-c

9、yclin A3在體外特異性結(jié)合，加入I4和I9，His-cyclin A3條帶明顯減弱，且小分子濃度越高，His-cyclin A3條帶減弱的程度越明顯。目前結(jié)果顯示，還需要對I4和I9做進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)優(yōu)化以提高它們的活性。這些研究結(jié)果為靶向作用于CDK2的別構(gòu)治療藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。
　　結(jié)論:(1)綜合利用分子對接、虛擬篩選結(jié)構(gòu)分析以及生物活性測試篩選出具有明顯的p-CDK2-cyclin A3抑制活性的先導(dǎo)化合物I4和I9

10、，I4和I9對p-CDK2-cyclin A3的IC50值分別為13.59μM和52.12μM;(2)通過改變ATP和底物肽的濃度初步證實(shí)了I4和I9是非競爭性抑制劑;(3)根據(jù)對接模型和定點(diǎn)突變技術(shù)初步驗(yàn)證了I4和I9靶向作用于CDK2底物位點(diǎn)以外的CDK2-cyclin A3相互作用界面附近的口袋，此口袋由Arg126，Arg150，Arg169和Tyr180等氨基酸殘基組成;(4)I4和I9對人源腫瘤細(xì)胞具有廣譜的生長抑制和細(xì)胞毒