Ⅱ型cGMP依賴性蛋白激酶對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)活性的影響.pdf

1、研究目的：研究Ⅱ型cGMP依賴性蛋白激酶(cGMP dependent protein kinaseⅡ，PKGⅡ)對(duì)人胃癌細(xì)胞增殖、遷移等生物學(xué)活性的影響。
　　 研究方法：
　　 (1)利用293A細(xì)胞擴(kuò)增重組腺病毒載體Ad-PKGⅡ及空載體Ad-LacZ，感染人胃癌細(xì)胞AGS、BGC-823、SGC-7901，用X-gaL染色和Western blotting方法檢測(cè)重組腺病毒對(duì)胃癌細(xì)胞的感染效率及感染后目的蛋白的表

2、達(dá)。選擇對(duì)重組腺病毒敏感的胃癌細(xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
　　 (2)以特異性激活PKGⅡ的cGMP類似物8-pCPT-cGMP作用感染或未感染的胃癌細(xì)胞，激活PKGⅡ，通過(guò)MTr試驗(yàn)、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的檢測(cè)，分析PKGⅡ?qū)θ宋赴┘?xì)胞增殖的影響；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PKGⅡ?qū)?xì)胞周期過(guò)程的影響。
　　 (3)DNA瓊脂糖凝膠電泳對(duì)DNA梯狀條帶分析及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高表達(dá)和活性增高的PKGⅡ?qū)θ宋赴┘?xì)胞凋

3、亡的影響。
　　 (4)通過(guò)Boyden槽遷移率分析法、刮除-遷移分析法和軟瓊脂培養(yǎng)、裸鼠攜瘤實(shí)驗(yàn)，觀察高表達(dá)和活性增高的PKGⅡ?qū)θ宋赴┘?xì)胞BGC-823遷移和致瘤性的影響。
　　 研究結(jié)果：
　　 (1)擴(kuò)增、鑒定重組腺病毒載體Ad-PKGⅡ和Ad-LacZ并感染胃癌細(xì)胞株，X-gaL染色和Western blotting結(jié)果表明，BGC-823對(duì)腺病毒最為敏感，在MOI=100時(shí)，感染效率為97±18％，且

4、持續(xù)高表達(dá)PKGⅡ蛋白。BGC-823細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖和遷移能力，所以選擇其為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株。
　　 (2)PKGⅡ在胃癌細(xì)胞高表達(dá)和活性增高可以有效抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，使單個(gè)細(xì)胞DNA合成減少，對(duì)EGF引起的PCNA表達(dá)增高具有明顯的抑制作用，并可使大量細(xì)胞阻滯于G1期，S期細(xì)胞減少，表明活化的PKGⅡ可以有效抑制細(xì)胞的增殖和周期的進(jìn)程。
　　 (3)流式細(xì)胞術(shù)及DNA瓊脂糖凝膠電泳分析發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)和活化的PKGⅡ?qū)ξ赴┘?xì)胞的

5、凋亡沒(méi)有明顯的影響。
　　 (4)PKGⅡ高表達(dá)和活性增高可以有效抑制人胃癌細(xì)胞BGC-823的遷移活動(dòng)，減弱細(xì)胞附著非依賴性生長(zhǎng)和抑制細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤。
　　 結(jié)論：
　　 PKGⅡ在胃癌細(xì)胞為低表達(dá)，感染重組腺病毒載體Ad-PKGⅡ后表達(dá)增高，以特異性激活PKGⅡ的cGMP類似物8-pCPT-cGMP作用后，可以有效抑制胃癌細(xì)胞BGC-823的增殖、遷移等生物學(xué)活性，而對(duì)細(xì)胞凋亡沒(méi)有明顯的影響。證實(shí)PKG