纈沙坦對心衰幼鼠心肌細胞內(nèi)鈣-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ干預研究.pdf

1、研究背景:隨著心血管疾病發(fā)病率的日益增多，對其發(fā)病機制以及治療方面的研究已經(jīng)成為國內(nèi)外醫(yī)學界研究的重點。心力衰竭是指在保持機體一定回心血量的情況下，心臟的收縮和（或）舒張功能下降以致絕對或相對不能滿足機體代謝需要的病理生理過程。兒科心力衰竭常見于先天性心臟病、心肌炎、心肌病或者嚴重呼吸道疾病的小兒。
　　 存在于正常心肌細胞內(nèi)的各種鈣穩(wěn)態(tài)相關(guān)蛋白已經(jīng)被廣泛認為在導致和促使心功能不全，電生理不穩(wěn)以及心律失常等事件中扮演著主要角色。

2、生物學功能多樣的鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ)是一種絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶，作為心肌鈣循環(huán)中重要的調(diào)控蛋白，其下游存在著豐富的靶位點并在心肌興奮-收縮偶聯(lián)(Excitation contraction coupling，ECC)過程中起著重要的支持作用。心肌細胞通過提高細胞內(nèi)鈣離子濃度激活CaMKⅡ。而當心臟負荷過重時，CaMKⅡ可過量激活，通

3、過影響部分鈣循環(huán)過程促進心臟衰竭和心律紊亂的發(fā)生發(fā)展。
　　 一般情況下，CaMKⅡ通過磷酸化作用介導L型鈣通道(L-typecalcium channel，LTCC)和蘭尼堿受體（Ryanodine receptor，RyR）的激活來調(diào)控ECC的正常過程。ECC初期，鈣流通過激活的LTCC進入心肌細胞，產(chǎn)生心肌去極化。這部分通過LTCC進入心肌細胞內(nèi)的少量鈣流進一步激活心肌肌漿網(wǎng)(Sarcoplasmic reticulum，

4、SR)上RyR受體，使其釋放大量鈣離子，這就是經(jīng)典的“鈣觸發(fā)鈣釋放”。通過心肌細胞內(nèi)SR釋放的足夠濃度的鈣離子是實現(xiàn)心肌細胞收縮和其他重要功能的關(guān)鍵。而在心臟舒張期開始時，受磷蛋白(Phospholamban，PLN)發(fā)揮負性調(diào)節(jié)作用，解除對心肌SR上Ca2+-ATP酶(Sarcoplasmicreticulum Ca2+-ATPase，SERCA)的抑制，通過SERCA回收心肌細胞中的鈣離子。在心血管疾病中，如果CaMKⅡ過表達，可通

5、過使LTCC、RyR和SERCA/PLN過磷酸化影響ECC過程，進而使心功能受損。
　　 既往研究中發(fā)現(xiàn)成年心功能不全動物中CaMKⅡ的表達增多，并與結(jié)構(gòu)性心臟病和心肌電生理紊亂有關(guān)，但針對幼年動物的心功能不全以及與CaMKⅡ的關(guān)系的研究尚處于空白。近年來有研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ除了磷酸化激活位點，尚可能存在活性氧(Reactive oxygenspecies，ROS)介導的氧化激活位點。故本課題組基于對心功能不全幼鼠模型的構(gòu)建，研

6、究纈沙坦對心功能不全幼鼠的治療效果以及相關(guān)的CaMKⅡ表達，并嘗試進一步探討CaMKⅡ可能的磷酸化和氧化激活過程。本研究主要分為以下三個部分:
　　 第一部分幼鼠腹主動脈部分縮窄的心功能不全模型的建立和評價
　　 目的:構(gòu)建心功能不全幼鼠模型。
　　 方法:通過腹主動脈縮窄術(shù)(Abdominal aortic constriction，AAC)構(gòu)建3周齡SD雄性幼鼠心功能不全模型(n=28)，縮窄直接約0.06

7、mm。同期構(gòu)建僅分離腹主動脈的假手術(shù)組幼鼠模型(n=8)。術(shù)后4周采用高頻超聲心動圖檢測各組大鼠左室收縮和舒張末期內(nèi)徑(Leftventricular-internal dimension systole,LVIDs; Left ventricular-internaldiastolic diameter，LVIDd)，左室收縮和舒張末期容積(Left ventricularend-systolic volume, LVESV; Lef

8、t ventricular end diastolic volume,LVEDV)，左室射血分數(shù)(Left ventricular ejection fraction，LVEF)，左室短軸收縮率（Left ventricular fractional shortening，LVFS）。
　　 結(jié)果:共28只幼鼠行AAC，其中有10只幼鼠在術(shù)中或術(shù)后1周死亡，AAC手術(shù)存活率約73.68％，假手術(shù)組無幼鼠死亡。經(jīng)過高頻超聲心動圖檢

9、測，與正常幼鼠相比，行AAC后4周的SD幼鼠LVIDs、LVESV升高（t=2.016,P=0.002; t=1.769,P=0.029），LVEF、LVFS降低(t=4.22，P＜0.001;t=5.339，P＜0.001)，LVIDd、LVEDV差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:成功構(gòu)建的心功能不全幼鼠模型，具有一定的術(shù)后存活率，并且心功能下降，以收縮功能降低為主。為進一步研究纈沙坦對幼鼠的治療效果和對CaMK

10、Ⅱ的影響提供了病理模型。
　　 第二部分纈沙坦對壓力負荷增高性心功能不全幼鼠心功能和心肌重構(gòu)的影響
　　 目的:研究纈沙坦對幼鼠心功能不全的治療效果。
　　 方法:術(shù)后1月，將心功能不全的18只幼鼠隨機分為心衰組(n=10)和治療組(n=8)。通過灌胃給予治療組幼鼠纈沙坦30 mg/(kg·d)治療4周，同時心衰組和假手術(shù)幼鼠給予安慰劑。各組幼鼠到達實驗終點時，采取高頻經(jīng)胸超聲檢測各組幼鼠LVIDs、LVIDd、

11、LVESV、LVEDV、LVEF、LVFS，分別計算左、右心室重量指數(shù)(Left ventricularmass index，LVMI; Right ventricular mass index， RVMI)，蘇木素-伊紅（Hematoxylin-eosin staining，HE）染色和Masson膠原染色觀察不同組幼鼠間心肌纖維形態(tài)和膠原增生情況。
　　 結(jié)果:經(jīng)過纈沙坦治療4周后，與假手術(shù)組(n=8)比較，心衰組(n=10

12、) LVIDs、LVESV均明顯升高(F=21.082，P＜0.001;F=14.178，P=0.001)，LVEF、LVFS均明顯降低(F=103.766，P＜0.001;F=62.953，P＜0.001)，LVMI明顯增加(F=13.272，P=0.01)，LVIDd、LVEDV和RVMI無明顯統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。纈沙坦組與假手術(shù)組相比，心功能以及心室重量指數(shù)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。與假手術(shù)組和治療組相比，HE染色顯示

13、心衰組心肌纖維增粗，直徑明顯增大(F=126.66，P＜0.001;P＜0.001)，紊亂，甚至發(fā)生心肌斷裂，Masson膠原染色顯示心衰組膠原纖維增生。而經(jīng)過纈沙坦治療，治療組和假手術(shù)心肌纖維增粗和膠原增生情況無明顯差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:與心衰組相比，治療組心功能不全情況得到極大改善，心室重量指數(shù)減小，心肌重構(gòu)較輕，顯示纈沙坦在治療幼鼠心衰方面有明顯療效。此部分研究為進一步探討心功能不全時CaMKⅡ的表達以及纈沙

14、坦在心衰治療中的可能機制奠定了基礎。
　　 第三部分纈沙坦對心功能不全幼鼠心肌細胞內(nèi)CaMKⅡ及其亞型表達和激活的干預研究
　　 目的:研究纈沙坦治療后心功能不全幼鼠心肌細胞內(nèi)CaMKⅡ、CaMKⅡ亞型及其磷酸化，氧化激活位點的表達情況，探討纈沙坦通過局部調(diào)節(jié)CaMKⅡ的表達治療幼鼠心功能不全可能的機制。
　　 方法:利用Western blot技術(shù)檢測各組幼鼠心肌細胞內(nèi)CaMKⅡ的表達，以及相關(guān)磷酸化位點(Th

15、r286)和氧化位點(Met281)的激活。
　　 結(jié)果:與假手術(shù)相比，心衰組心室肌細胞內(nèi)CaMKⅡ表達升高1.95倍(F=7.541，P=0.026)，CaMKⅡ亞型(δB+δ9)表達升高1.93倍(F=7.042，P=0.029)，CaMKⅡδc表達升高1.93倍(F=6.714，P=0.045)，CaMKⅡγ表達量極低在組間未見明顯差異(P＞0.05);Thr286-CaMKⅡ表達升高6.15倍(F=16.388，P＜0.

16、001)，Met81-CaMKⅡ表達稍升高但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。經(jīng)纈沙坦治療后，治療組與假手術(shù)組比較，CaMKⅡ、CaMKⅡ亞型以及相關(guān)活化位點的表達沒有顯著差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:心衰時CaMKⅡ被激活呈過表達，纈沙坦改善幼鼠心功能可能與其下調(diào)CaMKⅡ的過表達有關(guān)，其中亞型(δB+δ9)，δc的過表達在心功能不足的早期起著重要作用，而CaMKⅡγ表達量低，組間未發(fā)現(xiàn)明顯差異，其在心衰發(fā)展后期是否有所改變