鈣-鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ和MHC Ⅱ類分子對(duì)TLR觸發(fā)的巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞天然免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控及其機(jī)制研究.pdf

1、Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)作為一類重要的模式識(shí)別受體(Patternrecognition receptors，PRRs)主要表達(dá)于巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells，DCs)表面，選擇性地識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)，構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)抵御病原體入侵的第一道屏障。TLR是一類在各種生物體內(nèi)高度保守

2、的Ⅰ型跨膜蛋白，目前已在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)并克隆了12種。一旦識(shí)別了病原體中特定的分子結(jié)構(gòu)，TLR就會(huì)激活其下游一系列的信號(hào)通路，活化天然免疫細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素。TLR不僅啟動(dòng)天然免疫應(yīng)答，控制炎癥反應(yīng)的性質(zhì)、強(qiáng)度和持續(xù)時(shí)間，還可以通過上調(diào)DC表面的MHCⅡ類分子和共刺激分子，促進(jìn)DC的成熟，指導(dǎo)抗原特異的免疫應(yīng)答尤其是Th1型反應(yīng)的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)獲得性免疫應(yīng)答的強(qiáng)度和類型，成為連接初始免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的橋梁。TLR信號(hào)過

3、度活化或活化不足會(huì)導(dǎo)致機(jī)體功能異常和疾病的發(fā)生。許多的其他信號(hào)通路參與對(duì)TLR信號(hào)的嚴(yán)密調(diào)控。因此，對(duì)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的深入研究具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。 Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)第二信使之一，調(diào)節(jié)很多重要的生理過程。鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，CaMKII)是鈣信號(hào)下游的一種多功能絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布于機(jī)體大部分重要器官組織中。

4、它由四個(gè)獨(dú)立的基因α、β、γ及δ編碼，且存在著不同的剪切體，因而產(chǎn)生多達(dá)24種不同的同型物。CaMKII有著眾多的作用底物，如轉(zhuǎn)錄因子CREB、ATF及其他信號(hào)分子p56Ick、SHP-2、STAT1等。CaMKII可調(diào)節(jié)機(jī)體的多種重要生理功能，如突觸的信號(hào)傳遞、記憶、物質(zhì)的代謝、肌肉的收縮、基因的表達(dá)及細(xì)胞周期的調(diào)控。近年來研究表明CaMKII在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要的調(diào)控功能，如T細(xì)胞的活化和記憶，DC的成熟和抗原提呈。 LP

5、S(TLR4配體)被證明可以促發(fā)小鼠巨噬細(xì)胞胞漿中的鈣流，其對(duì)LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生有重要的作用，也有研究顯示CaMKII可增強(qiáng)血小板激活因子(PAF)預(yù)刺激的THP-1細(xì)胞中LPS誘導(dǎo)的TNF-α的產(chǎn)生。這些研究提示Ca2+和CaMKII可能參與了TLR4信號(hào)。然而，鈣和CaMKII在TLR配體誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子和Ⅰ型干擾素產(chǎn)生中的作用，以及Ca2+/CaMKII信號(hào)通路與TLR信號(hào)通路的交互作用及其相關(guān)機(jī)制目前尚不清楚(問題1

6、)。 MicroRNAs(miRNAs)是一類眾多的內(nèi)源性非編碼小RNA，參與很多的生理病理過程。miRNAs在免疫系統(tǒng)功能調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用，包括調(diào)控巨噬細(xì)胞的對(duì)外來病原體的初始免疫應(yīng)答，淋巴細(xì)胞的發(fā)育、分化和功能等等。然而，關(guān)于具有調(diào)控DC成熟和功能的作用的miRNA卻很少報(bào)道。既然CaMKII被證明在DC的成熟和功能中發(fā)揮重要的作用，且目前有關(guān)miRNA與CaMKII的研究尚未見報(bào)道，因此，我們想探索是否存在以及哪些m

7、iRNAs能通過直接作用于CaMKII，從而在DC的成熟、活化以及刺激T細(xì)胞的增殖方面發(fā)揮調(diào)節(jié)作用(問題2)。 以前的研究表明抗原刺激能誘導(dǎo)DC胞漿中鈣流的上升，而鈣和CaMKII均能調(diào)控DC的MHCⅡ類分子的表達(dá)，表明Ca2+/CaMKII與MHCⅡ類分子之間存在著相互調(diào)控。然而MHCⅡ分子被抗原之外的其他分子交聯(lián)后能否誘導(dǎo)CaMKII的活化尚不清楚(問題3)。 MHCⅡ類分子主要表達(dá)于DC、單核巨噬細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞

8、等專職抗原提呈細(xì)胞上，而這些細(xì)胞正是外來病原體成分等危險(xiǎn)信號(hào)的主要感應(yīng)細(xì)胞。一些研究表明MHCⅡ類分子可介導(dǎo)逆向信號(hào)，影響和調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的很多生理過程?；诖?，MHCⅡ類分子是否能感應(yīng)危險(xiǎn)信號(hào)或者對(duì)危險(xiǎn)信號(hào)激發(fā)的免疫反應(yīng)起調(diào)控作用，目前尚不清楚(問題4)。 我們對(duì)上述四個(gè)方面的科學(xué)問題及其可能的內(nèi)在聯(lián)系進(jìn)行了系統(tǒng)性的研究，分別從四個(gè)方面探討了CaMKII、靶向CaMKII的miRNA和MHCⅡ類分子這三類分子的相互作用和對(duì)TLR

9、觸發(fā)的巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞天然免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控及其機(jī)制。 一、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ?qū)LR觸發(fā)的巨噬細(xì)胞天然免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控及其機(jī)制研究 在碩士論文的研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)LPS、CpG ODN和poly(I：C)(分別為TLR4、TLR9和TLR3配體)能夠顯著地誘導(dǎo)CaMKlI的活化，表現(xiàn)為CaMKII(T286)磷酸化的增加和激酶活性的上升，同時(shí)利用CaMKII的特異抑制劑KN62抑制CaMKII的活性能顯

10、著降低TLR4、9、3配體誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-6和TNF-α以及IFN-β的產(chǎn)生，其下游信號(hào)機(jī)制是通過抑制MAPK、NF-κB和IRF3來介導(dǎo)。 綜上所述，TLR配體能誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞胞內(nèi)鈣的釋放以及CaMKII的活化，活化的CaMKII通過直接結(jié)合、磷酸化并活化TLR信號(hào)中重要的信號(hào)分子TAK1和IRF3，增強(qiáng)下游信號(hào)通路的活化，從而加強(qiáng)TLR配體誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，表明Ca2+/CaMK

11、II信號(hào)通路與TLR信號(hào)通路之間的交互作用是巨噬細(xì)胞充分活化所必需的。本部分研究發(fā)現(xiàn)了CaMKII的新的免疫調(diào)控功能及其所作用的靶分子，另外也豐富了TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控的研究?jī)?nèi)容，有助于進(jìn)一步深入認(rèn)識(shí)機(jī)體在抵御外來病原體時(shí)的免疫應(yīng)答反應(yīng)及其精細(xì)調(diào)控機(jī)制。 二、靶向CaMKII的miR-148/152對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟和功能的影響 DC的成熟與活化是初始免疫應(yīng)答和獲得性免疫應(yīng)答的重要基礎(chǔ)，多種調(diào)節(jié)因子參與維持DC的穩(wěn)態(tài)。以前

12、的研究表明CaMKII也是DC成熟和功能發(fā)揮的一重要調(diào)節(jié)分子，抑制CaMKII的活化可下調(diào)DC表面MHCⅡ類分子的表達(dá)、IL-12和IFN-γ的分泌以及CD4+T細(xì)胞的增殖。我們前一部分的研究表明CaMKII可以加強(qiáng)TLR配體誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎性細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生。既然DC也表達(dá)CaMKII，那么DC中的TLR信號(hào)也應(yīng)該受到CaMKII的正向調(diào)控。 綜上所述，miR-148/152通過作用于靶分子CaM

13、KII-α，從而負(fù)向調(diào)控TLR配體觸發(fā)的DC初始免疫應(yīng)答和抗原提呈功能。miR-148/152為一新的DC成熟和功能的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，為免疫應(yīng)答反應(yīng)的調(diào)控提供了另一種新的方式。 三、Ca2+/CaMKII與MHCⅡ類分子之間的相互調(diào)控 以前的研究表明抗原刺激能誘導(dǎo)DC胞漿中鈣流的上升，而上調(diào)的鈣信號(hào)是DC成熟和功能發(fā)揮所需的一種重要因素。CaMKII能調(diào)節(jié)DC的MHCⅡ類分子的表達(dá)，抑制CaMKII的活化不但能增加MHCⅡ

14、類分子的溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)和降解，還能抑制MHCⅡ mRNA的轉(zhuǎn)錄及穩(wěn)定性。然而，除了抗原之外其他分子交聯(lián)MHCⅡ類分子后引起的胞漿鈣流及CaMKII的活化尚不很清楚。我們發(fā)現(xiàn)，利用siRNA降低DC中CaMKII的表達(dá)可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的DC表面MHCⅡ類分子的上調(diào)表達(dá)，而用抗體交聯(lián)DC表面的MHCⅡ類分子能增強(qiáng)LPS未誘導(dǎo)的和誘導(dǎo)的CaMKII的活化。 四、MHCⅡ類分子逆向信號(hào)促進(jìn)TLR觸發(fā)巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答反應(yīng)

15、及其機(jī)制研究 目前對(duì)于MHCⅡ類分子的非經(jīng)典功能的研究比較少。既然MHCⅡ類分子與TLR均主要表達(dá)于專職抗原提呈細(xì)胞上，我們?cè)O(shè)想MHCⅡ類分子能否感應(yīng)或輔助感應(yīng)危險(xiǎn)信號(hào)，或者對(duì)危險(xiǎn)信號(hào)激發(fā)的免疫反應(yīng)具有調(diào)控作用昵?利用基因敲除小鼠及RNA干擾技術(shù)，我們對(duì)這一問題進(jìn)行了研究。與野生型小鼠(MHCⅡ+/+相比，MHCⅡ缺陷(MHCⅡ-/-)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞和骨髓來源的DC在LPS、CpG ODN和poly(I：C)刺激后，產(chǎn)生的IL

16、-6、TNF-α、IL-12和IFN-β顯著降低。在巨噬細(xì)胞和DC中干擾MHCⅡ類分子的表達(dá)后，也明顯降低了TLR配體誘導(dǎo)的上述細(xì)胞因子的分泌。 總之，我們四部分的內(nèi)容研究了CaMKII、靶向CaMKIIα的miR-148/152以及MHCⅡ類分子的相互作用及其對(duì)TLR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控及相關(guān)的機(jī)制，證明了CaMKII和MHCⅡ類分子是抗原提呈細(xì)胞-巨噬細(xì)胞和DC中TLR信號(hào)充分活化所必需的，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了新的可以調(diào)控DC成熟和功能的m