LAPF和CD11b負向調(diào)控天然免疫應答及其機制研究.pdf

1、天然免疫應答是機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線，但是，過度活化的天然免疫反應會導致組織器官的損傷，可導致自身免疫病的產(chǎn)生甚至造成病人死亡，所以，天然免疫應答反應需要及時活化以有效清除入侵的病原體，同時，其應答程度與持續(xù)時間也應控制在適度范圍內(nèi)以維持機體平衡，可見，天然免疫應答反應的負向調(diào)控對于機體維持免疫自穩(wěn)至關重要。近年來，發(fā)現(xiàn)與研究能夠負向調(diào)控天然免疫的細胞和分子逐步成為天然免疫研究領域的前沿熱點。本課題圍繞著兩個負向調(diào)控分子的作

2、用與相關機制，分兩部分開展了負向調(diào)控天然免疫應答及其機制研究，包括“LAPF抑制TLR觸發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α及其機制研究”和“CD11 b-Src信號通路促進M2型巨噬細胞產(chǎn)生及其機制研究”，以期通過我們的研究，加深對天然免疫調(diào)節(jié)和免疫自穩(wěn)的認識和理解。
　　第一部分 LAPF抑制TLR觸發(fā)巨噬細胞產(chǎn)生TNF-α及其機制研究
　　包含PH和FYVE結(jié)構(gòu)域的溶酶體相關凋亡誘導蛋白LAPF（又叫PLEKHF1）是我們實驗室從

3、人樹突狀細胞cDNA文庫中通過隨機大規(guī)模測序發(fā)現(xiàn)的一個新的溶酶體相關蛋白并于2005年報道其參與TNF-α誘導的腫瘤細胞凋亡。然而有關LAPF在天然免疫中的功能還沒有研究。在本課題中，我們制備了LAPF條件缺失的小鼠（lapfloxp/loxplyz2Cre+），發(fā)現(xiàn)LAPF條件缺失小鼠相比于雜合子對照小鼠在內(nèi)毒素休克模型中炎性細胞因子分泌增加，其中TNF-α顯著升高，同時肺臟和脾臟中TNF-α的mRNA水平也顯著升高，提示LAPF可能

4、負向調(diào)控天然免疫反應與炎癥發(fā)生。
　　通過體外細胞實驗，發(fā)現(xiàn)LAPF缺失的巨噬細胞在TLR配體刺激下分泌TNF-α升高并且TAK-1、IKKα/β和p65的磷酸化活化水平顯著提高，表明LAPF能夠抑制NF-κB信號通路的活化。利用IP-質(zhì)譜分析結(jié)合體外IP驗證，我們發(fā)現(xiàn)LAPF可以與TLR信號關鍵轉(zhuǎn)運蛋白TIRAP和MyD88結(jié)合，為進一步研究LAPF如何調(diào)控NF-κB信號通路、影響炎性細胞因子釋放奠定了基礎。
　　第二部分

5、 CD11b-Src信號通路促進M2型巨噬細胞產(chǎn)生及其機制研究
　　整合素信號對于天然免疫應答的調(diào)控一直是天然免疫的前沿熱點問題。整合素對于天然免疫細胞的分化、發(fā)育、遷移、粘附和活化均有十分重要的作用。CD11b是整合素Mac-1的α鏈，CD11b的抗體常常用來篩選出巨噬細胞或者其它髓系來源的單核吞噬細胞。巨噬細胞根據(jù)表型和行使功能的不同又可以分為M1型（經(jīng)典性活化的）巨噬細胞和M2型（替代性活化的）巨噬細胞，分別釋放出促炎性細胞

6、因子和抑炎性細胞因子，M1和M2型巨噬細胞的平衡對于天然免疫的調(diào)節(jié)和自穩(wěn)至關重要。我們實驗室以往發(fā)現(xiàn)CD11b能夠通過Src-Syk泛素化降解MyD88和TRIF，從而抑制天然免疫過程中TNF-α的產(chǎn)生。但是，CD11b-Src在巨噬細胞M1和M2的表型和功能中的作用并不清楚，值得進一步研究。
　　我們發(fā)現(xiàn)在體外誘導腸炎模型中，CD11b缺陷的小鼠以及利用Src抑制劑Dasatinib腹腔注射處理的小鼠，結(jié)腸部位的炎癥反應均更為嚴

7、重，小鼠TNF-α產(chǎn)量增加但IL-10的產(chǎn)量減少，同時，iNOS的表達增強但Arg-1的表達減弱。TNF-α和iNOS是M1型巨噬細胞的標志性分子，IL-10和Arg1是M2型巨噬細胞的標志性分子，這個現(xiàn)象提示了CD11b-Src信號可能促使巨噬細胞趨向于M2型巨噬細胞。為此，我們直接檢測了用Dasatinib處理并且誘導腸炎的小鼠結(jié)腸部位的巨噬細胞類型，發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細胞比例增加、M2型巨噬細胞比例減少。隨后我們開展了CD11b-Sr

8、c使巨噬細胞更趨向于M2型巨噬細胞相關機制研究，發(fā)現(xiàn)1）骨髓來源的巨噬細胞中CD11b-Src可以抑制IFN-γ誘導的M1型巨噬細胞標志分子iNOS的表達，CD11b-Src還能夠促進IL-4誘導的M2型巨噬細胞標志分子Arg-1和YM-1的表達;2)CD11b通過促進Src-Akt信號通路活化，促進了TLR誘導的STAT6活化和IL-10釋放。
　　進一步的機制研究發(fā)現(xiàn)，Src能夠增強IL-4信號通路的Akt和STAT6活化，這

9、兩者均被報道能夠促進M2型巨噬細胞表型分子的表達。但是，只有過表達STAT6能夠逆轉(zhuǎn)Src抑制劑對Arg1的下調(diào)作用，提示STAT6在此過程的重要作用。Src能夠和STAT6相互作用，形成復合體，也進一步提示Src能夠參與活化STAT6。在TLR信號刺激下，Src則通過促進PI3K的調(diào)節(jié)亞基p85的泛素化降解，促進PI3K-Akt信號通路活化，進而通過負向調(diào)控GSK促進AP-1的活化入核，最終促進IL-10的產(chǎn)生。
　　綜上，CD