HAT1和Siglec--G負(fù)向調(diào)控天然免疫應(yīng)答及其作用機(jī)制研究.pdf

1、免疫應(yīng)答是機(jī)體識(shí)別并清除“非我”的重要手段，當(dāng)且僅當(dāng)免疫應(yīng)答強(qiáng)度控制在一定范圍內(nèi)才能有效清除病原微生物并維持自身穩(wěn)態(tài)。本課題圍繞著“表觀分子HAT1的天然免疫功能研究”和“Siglec-G分子在病毒感染中負(fù)向調(diào)控Ⅰ型干擾素產(chǎn)生的機(jī)制研究”兩部分展開，以進(jìn)一步加深我們對(duì)免疫調(diào)節(jié)與免疫交叉調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)，和對(duì)病毒感染性疾病和自身免疫性疾病的預(yù)防和診療提供新思路。
　　第一部分 B型乙酰轉(zhuǎn)移酶HAT1負(fù)向調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)及其機(jī)制的研究

2、>　　組蛋白的乙?；?去乙?；^程調(diào)節(jié)著眾多生命活動(dòng)，不同位點(diǎn)的乙?；癄顟B(tài)，不論單一還是混合的，將產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)。新生組蛋白的乙?；揎桯4K5Ac、H4K8Ac和H4K12Ac被認(rèn)為與核小體的組裝成熟密切相關(guān)，而染色質(zhì)中H4K16、H3K56的乙酰化或去乙?；瘎t與基因的轉(zhuǎn)錄活化或沉默息患相關(guān)。組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶主要由A型乙?；D(zhuǎn)移酶和B型乙酰化轉(zhuǎn)移酶兩類構(gòu)成，前者包括GNAT家族、MYST家族、P300/CBP等，主要分布于細(xì)胞核

3、內(nèi)，后者主要包含組蛋白H4/H3乙酰轉(zhuǎn)移酶1(Histone acetyltransferases，HAT1)，其廣泛分布于在胞漿，少量分布于核內(nèi);組蛋白去乙酰化酶可粗略分為兩個(gè)大組分，HDAC1至HDAC11、SIRT1至SIRT7。然而，乙?；?去乙?；揎椩谔烊幻庖邞?yīng)答過程中的功能尚不清楚。在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中通過干擾RNA技術(shù)篩選我們發(fā)現(xiàn)，HAT1能負(fù)向調(diào)控TLR4信號(hào)所介導(dǎo)的白介素6（interleukin6，IL-6）的

4、產(chǎn)生。這完全出乎我們的意料，需要進(jìn)一步驗(yàn)證上述篩選結(jié)果。HAT1干擾后的小鼠巨噬細(xì)胞，經(jīng)各種病原體刺激后，包括PolyI∶C、LPS、CpG-ODN刺激以及RNA病毒SeV和DNA病毒HSV-1感染，所誘導(dǎo)表達(dá)的炎癥細(xì)胞因子IL-6和TNFαmRNA和蛋白水平均顯著高于對(duì)照組，而Ⅰ型干擾素表達(dá)相對(duì)不受影響。全細(xì)胞蛋白裂解液和胞漿胞核蛋白分離的免疫印跡實(shí)驗(yàn)提示，干擾后的腹腔巨噬細(xì)胞內(nèi)經(jīng)典的MAPK信號(hào)和NF-κB信號(hào)基本沒有改變。究竟是什

5、么原因?qū)е铝薍AT1干擾后IL-6選擇性上調(diào)呢？利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)，HAT1干擾后小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)IL-6啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K4Me3和H3Ac水平明顯升高。于是我們提出了可能的機(jī)制猜想:1、B型乙酰轉(zhuǎn)移酶可能和A型乙酰轉(zhuǎn)移酶存在相互競(jìng)爭(zhēng)，包括組蛋白的相同或相鄰位點(diǎn)的修飾;2、HAT1可能選擇性靶向到某種免疫抑制分子的啟動(dòng)子區(qū)，即干擾后存在“負(fù)負(fù)得正”的現(xiàn)象;3、HAT1很可能存在與炎癥密切相關(guān)的非組蛋白底物，直接參與該底物活性調(diào)

6、節(jié)。后續(xù)將深入機(jī)制研究，并在動(dòng)物模型上觀察HAT1在天然免疫應(yīng)答過程中的作用，以期為自身免疫性疾病的預(yù)防和診療提供理論保障和技術(shù)支持。
　　第二部分 Siglec-G負(fù)向調(diào)控RIG-I介導(dǎo)IFNβ產(chǎn)生的分子機(jī)制研究
　　RIG-I分子被公認(rèn)為胞漿RNA病毒識(shí)別的關(guān)鍵Sensor，由N端兩個(gè)caspase活化與募集結(jié)構(gòu)域(Caspase activation and recruitment domain，CARDs)、中間的含

7、有DEAD基序的解旋酶/ATP酶結(jié)構(gòu)域(DEAD Helicase/ATPase domain)和C端自我抑制結(jié)構(gòu)域（C-terminal regulatory domain，CTD）共同構(gòu)成，可識(shí)別短于1kb的雙鏈RNA和5'三磷酸RNA。在靜息時(shí)，RIG-I處于閉合態(tài)，即CTD覆蓋著CARDs，當(dāng)外源性短鏈dsRNA進(jìn)入到胞漿后，CTD打開并和解旋酶結(jié)構(gòu)域一起識(shí)別、結(jié)合RNA，使得CARDs結(jié)構(gòu)域暴露，親和下游接頭分子MAVS（Mi

8、tochondrial antiviral signaling）上CARDs發(fā)生寡聚化并形成朊蛋白樣結(jié)構(gòu)，進(jìn)而活化Ⅰ型干擾素表達(dá)。
　　為了進(jìn)一步研究RIG-I-MAVS-IFNβ信號(hào)通路的調(diào)控，尤其是RIG-I翻譯后修飾，我們研究團(tuán)隊(duì)前期進(jìn)行了小鼠原代巨噬細(xì)胞RNA病毒VSV感染模型基因芯片測(cè)序分析，和HEK293細(xì)胞RIG-I過表達(dá)后免疫沉淀-RIG-I蛋白復(fù)合體-質(zhì)譜分析，然后結(jié)合小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)并證實(shí)唾液酸結(jié)合性免

9、疫球蛋白樣凝集素分子Siglec-G能負(fù)向調(diào)控IFNβ的產(chǎn)生;Siglec-G敲除的腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)RNA病毒誘導(dǎo)后能產(chǎn)生更多的RIG-I蛋白（RIG-I半衰期被延長(zhǎng)了），而接頭分子MAVS表達(dá)相對(duì)恒定。即在RNA病毒感染下，Siglec-G能促進(jìn)RIG-I的降解。接下來，本課題對(duì)其中的分子機(jī)制進(jìn)行了深入的探究。我們利用預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果“Siglec-G通過胞內(nèi)段ITIM基序在病毒感染下能招募更多的SHP2分子”而“SHP2在一定條件下能和c-

10、Cbl相互作用，并能降解部分受體酪氨酸激酶(RTKs)”，推測(cè)c-Cbl可能是RIG-I的E3連接酶。原代巨噬細(xì)胞中c-Cbl的干擾的確能增加IFNβ的表達(dá);HEK293T重建實(shí)驗(yàn)也證實(shí)c-Cbl能促進(jìn)RIG-I發(fā)生K48多聚泛素化而降解。SHP2敲除的巨噬細(xì)胞VSV感染中，干擾了Siglec-G不影響IFNβ產(chǎn)生，但干擾了c-Cbl卻能顯著上調(diào)IFNβ產(chǎn)生，從而明確了Siglec-G-SHP2-c-Cbl-RIG-I通路的上下游順序。

11、免疫共沉淀和免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)表明，Siglec-G-SHP2-c-Cbl-RIG-I四聚體客觀存在于小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、RAW264.7和HEK293T細(xì)胞中，其中RIG-I的CTD結(jié)構(gòu)域?yàn)閏-Cbl相互作用所必需。為了進(jìn)一步明確c-Cbl靶向降解RIG-I的位點(diǎn)，我們構(gòu)建了一系列的RIG-I點(diǎn)突變，當(dāng)RIG-I第813位賴氨酸突變?yōu)榫彼岷?，則具備了抵抗c-Cbl K48位泛素化降解的功能。將RIG-I K813R和WT質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染入