CD11b調(diào)控枯否細(xì)胞NADPH氧化酶激活參與肝臟缺血-再灌注損傷的機(jī)制研究.pdf

1、隨著實體器官移植的發(fā)展，對于缺血/再灌注（I/R）損傷的研究已經(jīng)涉及到了大部分常見的移植器官，如肝臟、腎臟、胰腺和肺等。I/R損傷與器官移植中移植器官原發(fā)性無功能(PNF)的發(fā)生及移植器官的生存時間密切相關(guān)。I/R損傷再灌注期包含兩個階段:急性期和亞急性期。急性期主要表現(xiàn)為移植器官細(xì)胞的損傷（再灌注后3-6h），亞急性期主要表現(xiàn)為大量中性粒細(xì)胞的浸潤（再灌注后18-24h）。在肝臟I/R損傷的急性期，主要是肝臟巨噬細(xì)胞（枯否細(xì)胞，Kup

2、ffer cells）產(chǎn)生的一系列活性氧(ROS)直接造成組織損傷并引起一系列有害的細(xì)胞反應(yīng)，從而導(dǎo)致炎癥、細(xì)胞死亡和器官衰竭。這說明枯否細(xì)胞產(chǎn)生的ROS及作為其主要來源的NADPH氧化酶在I/R損傷中扮演了重要的角色。單核巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中是非常獨特的細(xì)胞，它們通過黏附在血管內(nèi)皮上，穿過血管膜并在炎癥部位聚集的方式在體內(nèi)移動。相當(dāng)多的證據(jù)表明枯否細(xì)胞作為一種肝臟內(nèi)特異性的巨噬細(xì)胞，對于肝臟的損傷起關(guān)鍵作用。通過內(nèi)毒素直接或間接激活的

3、枯否細(xì)胞可以引起一系列炎癥介質(zhì)和ROS的釋放，而枯否細(xì)胞的失活則能夠減輕肝臟的損傷。炎癥反應(yīng)和ROS的生成對于清除細(xì)菌、病毒和寄生蟲等病原微生物至關(guān)重要，然而過多和過久激活炎癥反應(yīng)對于宿主卻是有害的。研究表明表面受體整合素CD11b/CD18（也稱為macrophage-1 Ag，Mac-1）作為一種病原識別受體(PRR)，可以識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs）和損傷相關(guān)分子模式(DAMPs)，如革蘭氏陰性細(xì)菌來源的脂多糖(LPS)，

4、淀粉樣β蛋白（β-amyloid）和高遷移率族蛋白1(HMGB1)。而Mac-1的配體結(jié)合能力可能是由CD11b亞基中的A結(jié)構(gòu)域的固有性狀所決定的，這就提示CD11b對于Mac-1在宿主防御中起到關(guān)鍵作用。在體內(nèi)，CD11b是表達(dá)在吞噬細(xì)胞表面的主要整合素，介導(dǎo)吞噬細(xì)胞游出至炎癥器官及對血清調(diào)理的病原體的吞噬作用，包括產(chǎn)生ROS，釋放細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性顆粒。然而，CD11b在枯否細(xì)胞中的作用及其分子機(jī)制仍沒有得以闡明。
　　在本實

5、驗中，我們研究了CD11b和枯否細(xì)胞在肝臟I/R損傷中的作用、關(guān)系及其機(jī)制。首先我們建立穩(wěn)定、可靠的小鼠70％肝臟I/R損傷模型，通過檢測小鼠術(shù)后的生命體征、精神狀態(tài)變化情況及生存時間，確定最佳的I/R模型。然后，我們利用CD11b缺陷（C57BL/6背景，CD11b-/-）小鼠和野生型(C57BL/6，WT)小鼠驗證了CD11b在肝臟I/R中的作用及其效應(yīng)細(xì)胞。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步探索了CD11b參與肝臟I/R損傷的機(jī)制。
　

6、　一、小鼠70％肝臟I/R損傷模型的建立
　　目的:建立穩(wěn)定、可靠的小鼠70％肝臟I/R損傷模型。
　　方法:以C57BL/6小鼠作為實驗對象，分為假手術(shù)(sham)組和不同缺血時間的3組，每組5只，分別用無損顯微血管夾阻斷肝臟左葉和中葉血流50、60和70min，然后松開血管夾，恢復(fù)肝臟左葉和中葉血流，最后縫合腹部切口。術(shù)后10d觀察小鼠體重、有無厭食、精神狀態(tài)等體征，并比較各組生存時間和組織病理學(xué)變化。
　　結(jié)果:

7、50min組小鼠體重減輕最小，無厭食，精神狀態(tài)最佳，存活時間也最長，但肝臟組織病理學(xué)損傷程度也最輕;70min組小鼠體重減輕最多，厭食最嚴(yán)重，精神狀態(tài)最差，存活時間最短，全部在3d內(nèi)死亡;60min組小鼠各項指標(biāo)居中，最短生存時間為5天，表現(xiàn)出較明顯的組織損傷。
　　結(jié)論:本研究中70％肝臟I/R模型的缺血時間為60 min較合適。
　　二、CD11b在肝臟I/R損傷中的作用及其機(jī)制研究
　　目的:探索CD11b對肝臟

8、I/R損傷的影響及其機(jī)制。
　　方法:將體重相近(20-25g)的10只CD11b-/-小鼠和10只C57BL/6小鼠分別隨機(jī)分為CD11 b-/-sham組、CD11b-/-、WT sham組和WT組，每組5只。再灌注后不同時間點(1、3、6、12、24、48 h)取血液檢測轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)，肝組織樣本行HE染色和凋亡檢測，TRIzol試劑盒一步法提取肝組織細(xì)胞總RNA，檢測肝組織中TNF-α，IL-1β，IL-6，IL

9、-8和IL-10的mRNA表達(dá)情況。檢測脂質(zhì)過氧化終產(chǎn)物丙二醛(MDA)和谷胱甘肽（GSH/GSSG比率），確定各組小鼠的氧化應(yīng)激情況。然后用GdCl3清除C57BL/6小鼠枯否細(xì)胞并以免疫熒光檢驗清除效果，同時檢測再灌注3h后小鼠轉(zhuǎn)氨酶和TNF-α，明確枯否細(xì)胞的作用。檢測各組小鼠NADPH氧化酶活性和ROS產(chǎn)生情況，明確CD11b對肝I/R損傷的作用途徑。免疫印跡(Western blot)檢測p47phox及Src激酶，明確CD1

10、1b調(diào)控信號通路。免疫共沉淀（Immunoprecipitation）檢測Src與p47phox之間的關(guān)系。最后使用Src抑制劑PP2預(yù)處理枯否細(xì)胞，石蠟油體外模擬I/R，檢測NADPH氧化酶活性，ROS產(chǎn)生及Src與p47phox表達(dá)情況的變化。
　　結(jié)果:ALT、AST在3h達(dá)到峰值且CD11b-/-顯著低于WT小鼠，以后逐漸下降，至48h后恢復(fù)到正常水平。肝組織HE染色顯示CD11b-/-小鼠肝細(xì)胞壞死、充血和腫脹程度明顯輕

11、于WT小鼠，凋亡檢測顯示凋亡細(xì)胞數(shù)量也比WT小鼠少。CD11b-/-小鼠TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8表達(dá)低于WT小鼠，而IL-10表達(dá)卻高于WT小鼠。CD11b-/-小鼠I/R后MDA濃度顯著低于WT小鼠，而GSH/GSSG比率顯著高于WT小鼠。GdCl3清除枯否細(xì)胞后GdCl3處理組和CD11b-/-組的小鼠I/R后ALT和AST水平及TNF-α表達(dá)水平明顯低于未使用GdCl3組的WT小鼠。CD11b-/-小鼠的NADP

12、H氧化酶活性及ROS產(chǎn)生也低于WT小鼠。進(jìn)一步檢測顯示，CD11b-/-小鼠枯否細(xì)胞中p47phox磷酸化水平在再灌注3h后顯著低于WT組小鼠，且p47phox與Src激酶相結(jié)合。使用PP2后體外模擬I/R，小鼠NADPH氧化酶活性下降，ROS產(chǎn)生減少，且p47phox與Src激酶磷酸化水平均降低。
　　結(jié)論:枯否細(xì)胞上的整合素CD11b能夠調(diào)控肝臟I/R損傷，尤其是在再灌注的早期階段。而且，我們發(fā)現(xiàn)CD11b的調(diào)控作用是依賴Sr