IRAK-4在內(nèi)毒素誘導(dǎo)的再灌注期移植肝臟枯否細(xì)胞激活中的調(diào)控作用.pdf

1、目的：缺血再灌注損害(ischemia／reperfusioninjury，I／RI)是導(dǎo)致移植肝功能不良或無功能、進(jìn)而造成移植失敗，機(jī)體死亡的重要原因之一，目前仍無有效的治療對策。全身80％一90％的單核一巨噬細(xì)胞為滯留于肝血竇內(nèi)的kupffer細(xì)胞(kupffercells，KCs)。實(shí)際上，KCs過度激活導(dǎo)致促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子一Q(tumornecrosisfactor，TNF-~)釋放是引發(fā)肝臟工／RI的關(guān)鍵因素。已證實(shí)

2、內(nèi)毒素是造成肝移植再灌注期KCs過度激活的重要原因之一。內(nèi)毒素是革蘭氏陰性桿菌生長時釋放或死亡時裂解出來的細(xì)胞壁脂多糖(1ipopolysacharide，LPS)成分，主要通過與單核一巨噬細(xì)胞相結(jié)合而誘導(dǎo)相應(yīng)的生物效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，大鼠經(jīng)小劑量內(nèi)毒素預(yù)處理誘導(dǎo)內(nèi)毒素耐受(endotoxintolerance，ET)后，能對隨之發(fā)生的I／R工產(chǎn)生交叉耐受(cross-toleration)作用，此時TNF—Q含量明顯下降，工／R工程度顯著

3、減輕，但其相關(guān)機(jī)制并未完全闡明。最新研究表明，白細(xì)胞介素一1受體相關(guān)激酶一4(interleukin一1receptorassociatedkinase-4，IRAK-4)是位于NF-KB上游的調(diào)節(jié)內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最關(guān)鍵因子[3]。工RAK-4不僅可能是LPS信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的最關(guān)鍵調(diào)控分子，其活性變化還可能是誘導(dǎo)ET形成的最關(guān)鍵因素，因此也應(yīng)該是最理想的治療靶點(diǎn)。 目前，臨床上對I／R工的防治并無有效的手段；而內(nèi)毒素臨床應(yīng)用的安全性尚

4、有待評估，同時在術(shù)前數(shù)天給于內(nèi)毒素預(yù)處理供體以期誘導(dǎo)盯也并不現(xiàn)實(shí)，因此如能證實(shí)IRAK一4活性改變也是內(nèi)毒素預(yù)處理誘導(dǎo)的對I／RI交叉耐受的關(guān)鍵步驟，將有可能為防治肝移植I／R工的基因治療提供理想的治療靶點(diǎn)。然而，作為2002年才被發(fā)現(xiàn)的IRAK家族最新成員，還有許多問題尚待解決：①誘導(dǎo)ET后，最終能抑制工RAK一4活性，但目前并未分離出明確的活性調(diào)控蛋白。IRAKs家族活性的變化可能是田形成的最關(guān)鍵因素，是由于其他信號轉(zhuǎn)遞因子均不是誘

5、導(dǎo)ET形成的必需條件。由于認(rèn)知的局限性，并不能排外關(guān)鍵性調(diào)控因子尚未被發(fā)現(xiàn)的可能，因此IRAK一4活性的變化是否是ET形成的最關(guān)鍵因素仍有待進(jìn)一步證實(shí)。②現(xiàn)有的研究均以腹腔或血液巨噬細(xì)胞，甚至腫瘤性巨噬細(xì)胞株等為研究對象，尚無研究工RAK-4在KCs內(nèi)毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的調(diào)控效應(yīng)；也未涉及因?yàn)楦我浦?其血液LPS濃度明顯低于實(shí)驗(yàn)用LPS濃度，但KCs對LPS高度敏感)的特殊情況下IRAK一4的調(diào)控作用。更無抑制IRAK一4表達(dá)后，對I／R工

6、是否具有交叉耐受效應(yīng)的研究。③另外，IRAK-4基因敲除動物或IRAK-4基因突變的患者，因?qū)PS永久性無應(yīng)答會導(dǎo)致反復(fù)嚴(yán)重的細(xì)菌感染。I／RI只是肝移植早期的一個病理生理過程，那能否短暫封閉特定靶器官的IRAK一4基因，而不會長期干擾機(jī)體對細(xì)菌的清除? 因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們將觀察：①以內(nèi)毒素耐受(ET)為基礎(chǔ)誘導(dǎo)的大鼠移植肝臟對缺血再灌注損害(工／RI)交叉耐受的過程中，白細(xì)胞介素一1受體相關(guān)激酶一4(工RAK-4)及相關(guān)內(nèi)

7、毒素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子表達(dá)的變化，分析內(nèi)毒素在移植肝臟工／RI中的作用及誘導(dǎo)盯建立交叉耐受與IRAK一4表達(dá)改變的關(guān)系。②利用siRNA技術(shù)的轉(zhuǎn)錄后沉默特性，探討以工RAK一4特異性短發(fā)夾RNA(shRNA)對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的枯否細(xì)胞(KCs)激活效應(yīng)的可行性。③通過觀察活體或冷保存期離體門靜脈灌注大鼠供肝，轉(zhuǎn)染IRAK-4shRNA對再灌注后受體肝臟工／R工及內(nèi)毒素效應(yīng)相關(guān)因子表達(dá)的影響，判斷以IRAK-4為肝移植I／RI治療靶點(diǎn)的可行性并探索

8、可行的shRNA治療途徑。如果能證實(shí)IRAK-4在LPS誘導(dǎo)的KCs激活中的作用，在基因治療日益向臨床過渡的今天，將為肝移植工／R工的基因治療或藥物開發(fā)提供新的靶點(diǎn)，具有較大的理論意義和臨床應(yīng)用前景。 方法①雄性SD大鼠，隨機(jī)分為正常對照組、缺血再灌注組(I／R組)和內(nèi)毒素耐受組(ET組)。以未經(jīng)任何處理的大鼠肝臟為正常對照；盯組供體第M經(jīng)尾靜脈給予脂多糖(LPS)0．1mg．kg-'，第2d、3d、4d、5d給予0．5mg．k

9、g-1；I／R組供體給予等體積0．5ml無菌PBS液。第8d，切取供體，以未經(jīng)任何處理的大鼠為受體，兩袖套法建立大鼠原位肝移植模型。按門靜脈血流恢復(fù)后第Omin、60min及180min分為三個亞組。光鏡及電鏡檢查肝臟組織的病理改變情況；免疫組織化學(xué)及逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測定肝組織的IRAK一4mRNA和蛋白表達(dá)水平；酶連免疫吸附法(ELISA)肝組織核因子一KB(NF-KB)活性及血清腫瘤壞死因子一Q(TNF—Q)含

10、量。②構(gòu)建2對表達(dá)IRAK-4-shRNA的陽性載體質(zhì)粒(pSIIRAK-4-A，pS工IRAK-4-B)及l(fā)對陰性載體質(zhì)粒(pS工IRAK一4-C)。分離培養(yǎng)Balb／C小鼠KCs，分為正常對照組，RNAi對照組(轉(zhuǎn)染pSIIRAK一4-C)與RNAi抑制組(轉(zhuǎn)染pS工IRAK-4一A，pSI工RAK一4-B)。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后24h，加入0．1μg·ml-1LPS。6h后，蛋白免疫印記法(Western-blot)及24一PCR測定IRA

11、K-4蛋白和mRNA表達(dá)水平；ELISA檢測0h，1h，3h，6h，12h后KCs的核因子一KB(NF一KB)活性及培養(yǎng)上清液TNF-Q含量。③雄性SD大鼠，隨機(jī)分為冷缺血轉(zhuǎn)染組、活體轉(zhuǎn)染組、對照組，以兩袖套法建立同種異體肝移植模型。冷缺血轉(zhuǎn)染組于冷缺血期經(jīng)門靜脈灌注轉(zhuǎn)染攜帶IRAK-4-shRNA的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pS工IRAK-4-A；活體轉(zhuǎn)染組在門靜脈袖套吻合完成后，經(jīng)門靜脈分支注入pSIIRAK-4-A；對照組不予任何處理。按門靜脈血流

12、恢復(fù)后第Omin、60min及180min分為三個亞組，光鏡及透射電鏡檢查肝臟組織的病理形態(tài)學(xué)改變情況；免疫組織化學(xué)，Western-b10t及RT-PCR測定肝組織工RAK-4蛋白和mRNA表達(dá)；ELISA法檢測肝組織NF一KB活性及血清TNF—Q含量。 結(jié)果①再灌注后Omin、60min及180min，I／R組與ET組的IRAK一4蛋白與mRNA表達(dá)水平，NF-KB活性以及TNF-Q含量均高于正常對照組(P<0．01)；再灌

13、注后Omin，工／R組與盯組的NF-KB活性以及TNF-Q含量差別無顯著性(P>0．05)，但I(xiàn)RAK-4蛋白與mRNA表達(dá)水平高于ET組(P<0．01)；再灌注60min及180min，I／R組的上述各指標(biāo)均明顯高于后者(P<0．01)。再灌注后180min，ET組僅見輕度肝細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤；I／R組的肝細(xì)胞、血竇內(nèi)皮中度腫脹，血竇擴(kuò)張，內(nèi)有較多KCs和中性粒細(xì)胞浸潤，部分血竇內(nèi)皮消失，直接完全暴露的肝細(xì)胞個別見壞死

14、，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張明顯。②RNAi抑制組IRAK一4表達(dá)水平，以及LPS刺激后1h，3h及6h的NF-KB活性、TNF-Q含量均明顯低于正常對照組和RNAi對照組(P<0．01)；尤其是pSI工RAK-4一A組，LPS刺激前后上述各指標(biāo)差異無顯著性(P>0．05)，抑制效果明顯優(yōu)于pS工工RAK一4一B(P<0．0D。③再灌注后活體轉(zhuǎn)染組、對照組的工RAK-4蛋白與mRNA表達(dá)水平、NF-KB活性以及TNF-Q含量均高于冷缺血轉(zhuǎn)染組(P<0．

15、01)；冷缺血轉(zhuǎn)染組的IRAK-4表達(dá)明顯抑制，再灌注后各時點(diǎn)差異無顯著性(P>0．05)。再灌注后180min，冷缺血轉(zhuǎn)染組超微結(jié)構(gòu)改變與內(nèi)毒素預(yù)處理后相似，僅見輕度肝細(xì)胞、竇內(nèi)皮細(xì)胞腫脹和炎癥細(xì)胞浸潤；而活體轉(zhuǎn)染組表現(xiàn)出明顯的肝臟病理改變：其肝細(xì)胞明顯氣球樣變、線粒體、血竇內(nèi)皮中度一重度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及血竇明顯擴(kuò)張，內(nèi)有較多KCs和中性粒細(xì)胞浸潤；部分血竇內(nèi)皮消失，暴露的肝細(xì)胞直接與KCs接觸，甚至可見個別肝細(xì)胞壞死。 結(jié)論①