DR5在內(nèi)毒素誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡中的作用.pdf

1、內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外膜的成份，其主要組成部分是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。有研究顯示LPS能夠激活包括外周血單核細(xì)胞在內(nèi)的各種細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞分化成熟或產(chǎn)生各種內(nèi)源性的活性物質(zhì)，如TNFs，IFNs，ILs和CSFs等。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)許多細(xì)菌感染能觸發(fā)或抑制細(xì)胞凋亡，并且有結(jié)果顯示細(xì)菌引起的細(xì)胞凋亡中有腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL(TNF-relateapoptosis-inducing lig

2、and TRAIL)的參與。TRAIL又稱(chēng)為凋亡素2配體(APO-2L)。它屬于TNF超基因家族成員，正如該家族的其他成員一樣，TRAIL以Ⅱ型跨膜蛋白為主要表達(dá)方式。TRAIL能夠誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡而對(duì)大多數(shù)正常細(xì)胞無(wú)影響。它通過(guò)與腫瘤細(xì)胞膜上的相應(yīng)受體結(jié)合誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，目前已發(fā)現(xiàn)TRAIL有5個(gè)受體，其中TRAIL受體1(死亡受體4 death receptor 4，DR4)和TRAlL受體2(死亡受體5death recepto

3、r 5，DR5)胞內(nèi)段含有死亡結(jié)構(gòu)域，能夠傳遞凋亡信號(hào)，TRAIL通過(guò)與細(xì)胞膜上的DR4或DR5相互作用從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在生理?xiàng)l件下DR5與TRAIL的親和力明顯大于DR4，因此，在TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程中起主要作用的受體是DR5。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞凋亡，但內(nèi)毒素引起細(xì)胞凋亡的機(jī)制還不完全清楚。內(nèi)毒素引起細(xì)胞凋亡與TRAIL的相關(guān)性如何鮮見(jiàn)報(bào)道。為探索TRAIL在內(nèi)毒素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的潛在作用，我們進(jìn)行本項(xiàng)目的研究

4、。 目的：主要探討TRAIL的受體DR-5在內(nèi)毒素引起肝細(xì)胞凋亡中的作用及可能機(jī)制，并為進(jìn)一步研究?jī)?nèi)毒素與其它細(xì)胞因子在肝細(xì)胞凋亡中的作用提供指導(dǎo)，同時(shí)也為臨床上肝病治療研究提供新的思路。 方法：實(shí)驗(yàn)分體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)兩部分。 第一部分：體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，將人肝HL7702細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)貼壁后，分為對(duì)照組、內(nèi)毒素處理組、抗人DR5單抗mDRA-6處理組及聯(lián)合組(內(nèi)毒素+mDRA-6)。在做不同處理后倒置顯微鏡

5、下觀(guān)察L02細(xì)胞形態(tài)變化；MTT法檢測(cè)內(nèi)毒素對(duì)L02細(xì)胞生長(zhǎng)的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)L02細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率；Annexin-V和PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。 第二部分：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，選用6-8周齡的健康BALB/c小鼠，實(shí)驗(yàn)分為三組：陰性對(duì)照組、單獨(dú)內(nèi)毒素處理組和DR5封閉TRAIL組。在做不同處理后檢測(cè)小鼠血清中ALT、AST和LDH含量變化；HE染色鏡下觀(guān)察肝細(xì)胞凋亡；Annexin-V和PI雙染法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡率；流式細(xì)胞術(shù)

6、檢測(cè)肝細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率；免疫組化檢測(cè)肝細(xì)胞DR5的表達(dá)。 結(jié)果： 1.經(jīng)LPS處理的L02細(xì)胞呈現(xiàn)明顯的凋亡形態(tài)特征，出現(xiàn)核固縮、染色質(zhì)邊緣化、凋亡小體形成。流式細(xì)胞術(shù)分析表明：對(duì)照組L02細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率為4.8％，用LPS(10 mg/L)處理12 h后，DR5表達(dá)率上調(diào)為37.76％。L02細(xì)胞12h凋亡率：LPS處理組、抗人DR5單抗mDRA-6處理組、LPS聯(lián)合mDRA-6組細(xì)胞凋亡率分別為37.7

7、8％(早期凋亡21.65％，晚期凋亡16.13％)、29.58％(早期凋亡18.21％，晚期凋亡11.37％)和65.81％(早期凋亡50.61％，晚期凋亡15.20％)(p<0.05)。 2.經(jīng)LPS處理后小鼠血清中ALT、AST和LDH的含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)呈進(jìn)行性升高，在處理24h三種酶的含量達(dá)到最高峰，隨后開(kāi)始下降。HE染色鏡下觀(guān)察單獨(dú)內(nèi)毒素處理組肝細(xì)胞凋亡較多，可見(jiàn)細(xì)胞體積縮小，胞質(zhì)致密深染，形成致密質(zhì)塊，并出現(xiàn)凋亡小體。

8、DR5封閉TRAIL組細(xì)胞凋亡減少。流式檢測(cè)小鼠肝細(xì)胞凋亡率：?jiǎn)为?dú)內(nèi)毒素處理組細(xì)胞凋亡率為45.02％(早期凋亡為13.59％，晚期凋亡為31.43％)。DR5封閉TRAIL組小鼠肝細(xì)胞凋亡率27.62％(早期凋亡為11.47％，晚期凋亡為16.15％)；免疫組化染色觀(guān)察細(xì)胞DR5的表達(dá)：?jiǎn)为?dú)內(nèi)毒素處理組小鼠肝細(xì)胞DR5的表達(dá)率比對(duì)照組明顯增高。流式檢測(cè)對(duì)照組小鼠肝細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率是4.21％；單獨(dú)內(nèi)毒素處理組小鼠肝細(xì)胞DR5的表

9、達(dá)率明顯增高為46.71％。 結(jié)論：1.內(nèi)毒素可以通過(guò)上調(diào)細(xì)胞表面DR5的表達(dá)誘導(dǎo)人肝細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率與內(nèi)毒素的劑量及細(xì)胞表面DR5表達(dá)率呈相關(guān)性，內(nèi)毒素引起的人肝細(xì)胞凋亡是TRAIL的受體DR5起主要作用。 2.內(nèi)毒素可以誘導(dǎo)小鼠肝細(xì)胞凋亡，并且在內(nèi)毒素誘導(dǎo)下細(xì)胞表面DR5的表達(dá)率明顯增高。sDR5可以和小鼠體內(nèi)的TRAIL相結(jié)合使肝細(xì)胞凋亡減少，內(nèi)毒素可以通過(guò)上調(diào)小鼠肝細(xì)胞表面DR5的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，內(nèi)毒素誘