IRAK家族在內(nèi)毒素耐受大鼠肝組織中的作用研究.pdf

1、目的：
　　 急性肝衰竭（acuteliverfailure，ALF）是一種進展迅速、病死率較高的嚴(yán)重的臨床疾病。雖然經(jīng)過多年的研究，已形成了以肝移植術(shù)為主的多種治療方法，但目前尚無有效的臨床藥物，其預(yù)后及病死率仍然不容樂觀。
　　 ALF時機體免疫反應(yīng)的參與在肝衰竭的形成中起著至關(guān)重要的作用。大量炎性細胞因子參與了該免疫過程。這些細胞因子直接參與了細胞凋亡的誘導(dǎo)，并通過級聯(lián)放大作用放大免疫損傷，同時還可引起局部循環(huán)改變

2、，造成組織細胞缺氧，加重凋亡壞死的發(fā)生。其中Toll樣受體(Toll-Iikereceptor4，TLR4)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在炎性壞死過程中發(fā)揮重要的作用。
　　 脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)是一種常見的致病原，能刺激多種炎性介質(zhì)釋放，在細菌感染及急性肝衰竭等疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中有著重要作用。細胞信號因子TLR4能識別細菌的LPS，同時其下游因子NF-κB是炎性反應(yīng)關(guān)鍵因子，參與TNF-α及IL-6等眾

3、多炎性細胞因子的表達。預(yù)先給予小劑量LPS刺激機體后，機對致死劑量LPS表現(xiàn)為低反應(yīng)性或無反應(yīng)性的現(xiàn)象，被稱為內(nèi)毒素耐受(endotoxintolerance，ETT)。ETT的確切機制目前尚不清楚。因此我們設(shè)想通過誘導(dǎo)ETT，削弱TLR4及其他與炎性壞死相關(guān)的信號通路，由此減少ALF時機體各種炎性細胞因子的產(chǎn)生，減輕ALF所造成的機體損傷。
　　 本研究通過對比內(nèi)毒素耐受(ETT)及正常大鼠接受D-胺基半乳糖(D-GalN)/

4、脂多糖(LPS)刺激后肝組織IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)家族基因表達的異同，探討內(nèi)毒素耐受的可能機制。
　　 方法：健康雄性大鼠66只，分為正常對照組、急性肝功能衰竭(ALF)組和內(nèi)毒素耐受組（ETT組）。ETT組與ALF組分別以0.1mg/kgLPS和生理鹽水腹腔注射每日1次，連續(xù)5天。第5天晚開始禁食。禁食24h后，ETT組與ALF組同時腹腔注射D-GalN800mg/kg和LPS8μg/只，分別在注射D-GalN/LP

5、S后2、6、12、24和48h5個時間點留取大鼠血及肝臟標(biāo)本。HE染色光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織的病理變化；ELISA法檢測血清腫瘤壞死因子α(TNF-α)及白介素6(IL-6)的水平；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測Toll樣受體(toll-likereceptor4，TLR4)、髓樣細胞分化因子88(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)、白細胞介素-1受體相關(guān)激酶1（IRAK-1）、IRAK-

6、4、IRAK-M、核因子κB(NF-κB)(p65)mRNA表達情況；計量資料各組間均數(shù)比較兩兩比較采用LSD檢驗和Dunnet'sT檢驗。
　　 結(jié)果：
　　 HE染色光鏡下對照組肝小葉結(jié)構(gòu)完整，肝細胞染色質(zhì)豐富，形態(tài)飽滿，核膜清楚。與對照組大鼠肝組織相比，ALF組大鼠肝細胞損傷嚴(yán)重，小葉結(jié)構(gòu)破碎，肝細胞條索紊亂，肝細胞水腫、變性，部分細胞溶解碎裂，同時匯管區(qū)可見大量炎性細胞浸潤：ETT組大鼠肝細胞損傷程度相對較輕，小

7、葉結(jié)構(gòu)大致尚可，條索稍顯松散，匯管區(qū)可見少量炎性細胞浸潤，整體病理改變輕于ALF組。
　　 電鏡下對照組肝細胞核圓，核仁可見，形態(tài)完整，胞質(zhì)豐富，線粒體嵴可見。ALF組肝細胞損傷嚴(yán)重，嚴(yán)重者細胞核結(jié)構(gòu)完全消失，線粒體腫脹，結(jié)構(gòu)模糊，細胞器雜亂聚集。與ALF組相比，ETT組情況相對較好，核結(jié)構(gòu)尚存，形狀不規(guī)則，核仁未見，染色質(zhì)邊集，核間隙稍寬。胞質(zhì)中線粒體腫脹明顯，嵴結(jié)構(gòu)消失，細胞器而聚集，程度輕于ALF組。
　　 ETT

8、組血清TNF-α、IL-6水平明顯低于ALF組（IL-6:2h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為150.580、235.408、396.769、49.938、483.18，P值均＜0.05；TNF-α：2h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為12.674、18.602、21.840、21.518、23.346，P值均＜0.05）；
　　 ALF組大鼠肝組織TLR4、IRAK1、IRAK-4及NF-κ

9、B(p65)mRNA表達明顯上調(diào)，而IRAK-M表達則明顯下降；ETT組的IRAK-MmRNA表達較ALF組明顯上升，同時TLR4、IRAK1、IRAK-4，P65表達相對降低(TLR42h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為62.857、172.840、198.626、328.046，190.215，P值均＜0.05;MyD882h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為127.792、598.408、1120

10、.344、1915.110、1291.417，2小時組P=0.179，余P值均＜0.05;IRAK12h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為6640.496、23792.434、27460.046、22237.509、8156.029，P值均＜0.05;IRAK-4:2h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為17.305、54.921、121.031、67.607、55.279,P值均＜0.05;NF-κB(p

11、65):2h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為19.506、43.777、110.823、302.681、202.822，P值均＜0.05;IRAK-M:2h組、6h組、12h組、24h組、48h組F值分別為172.003、59.519、987.055、68.463、96.601,P值均＜0.05)。
　　 結(jié)論：誘導(dǎo)ETT可使D-GalN/LPS對大鼠肝組織損害減輕。TNF-α、IL-6釋放減少，可能與TLR4