OX40在內(nèi)毒素耐受大鼠肝組織中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的:急性肝功能衰竭(ALF)可在短時(shí)間內(nèi)導(dǎo)致大量肝細(xì)胞壞死，引起肝功能嚴(yán)重障礙，其并發(fā)癥多，死率高達(dá)50％，ALF逐漸成為危害全球人類健康嚴(yán)重疾病之一。前人的研究已發(fā)現(xiàn)多種肝衰竭的發(fā)病機(jī)制，免疫功能破壞、組織細(xì)胞炎癥反應(yīng)和機(jī)體內(nèi)毒素血癥等都是重要環(huán)節(jié)，其中機(jī)體免疫功能受損起關(guān)鍵作用，免疫功能受損后肝組織炎癥以及產(chǎn)生的細(xì)胞因子連鎖反應(yīng)可刺激多種炎癥介質(zhì)大量釋放，進(jìn)而進(jìn)一步加重肝組織損傷。
　　 共刺激分子OX40是屬TNF-受體

2、家族成員之一，可以部分逆轉(zhuǎn)大鼠T細(xì)胞數(shù)量減少的趨勢(shì)，并促使CD4+T細(xì)胞等炎癥細(xì)胞進(jìn)入外周血中，再移行到炎癥部位，刺激T細(xì)胞釋放多種炎癥因子，進(jìn)一步放大機(jī)體對(duì)炎癥刺激的反應(yīng)能力，進(jìn)而誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷甚至凋亡。
　　 脂多糖(LPS)是內(nèi)毒素主要成分，內(nèi)毒素耐受(ETT)是指先給予小劑量LPS或類似的物質(zhì)刺激機(jī)體或者單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)后，機(jī)體或細(xì)胞對(duì)致死量的LPS表現(xiàn)出低反應(yīng)性甚至無(wú)反應(yīng)性。目前，有越來(lái)越多學(xué)者投入到ETT對(duì)肝衰竭影

3、響的研究當(dāng)中，但ETT形成的具體機(jī)制尚未明確。
　　 本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察內(nèi)毒素耐受及正常大鼠接受D-胺基半乳糖(D-GaiN)/LPS注射后肝組織OX40表達(dá)的變化，探討內(nèi)毒素耐受發(fā)生的可能機(jī)制。
　　 方法:雄性SD大鼠54只，按隨機(jī)數(shù)字表法分為:正常對(duì)照組:6只;急性肝功能衰竭(ALF)組:24只;內(nèi)毒素耐受(ETT)組:24只。前5日ETT組通過(guò)腹腔注射0.1mg/kg脂多糖(LPS)，ALF組注射生理鹽水，每日1次，

4、后1天同時(shí)注射LPS8μg/只+D氨基半乳糖(D-GalN)800 mg/kg，注射后6、12、24和48h取SD大鼠門靜脈血以及肝臟。按0.35 mL/kg用10％水合氯醛行腹腔注射麻醉，剖腹用注射器經(jīng)下腔靜脈采血，離心留取血清，將部分肝組織固定于10％中性福爾馬林溶液中，石蠟包埋、切片，剩余肝組織用液氮凍存，放入-80℃冰箱。全自動(dòng)生化儀器測(cè)血清ALT、AST水平。蘇木-伊紅(HE)染色下觀察肝組織病理學(xué)變化。 RT-PCR法檢測(cè)大

5、鼠肝組織OX40 mRNA表達(dá)。Western blot法測(cè)定肝組織OX40蛋白表達(dá)。ELlSA法按試劑盒操作測(cè)血清白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-a)水平。結(jié)果采用單因素方差分析法、LSD法、Dunnett's T3分析。
　　 結(jié)果:
　　 1.成功完成構(gòu)建SD大鼠ALF模型:HE染色下肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝索連續(xù)性破壞，肝細(xì)胞嗜酸性變、壞死，匯管區(qū)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)。ETT組與ALF組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，可見

6、浸潤(rùn)的炎細(xì)胞明顯減少，肝細(xì)胞腫脹以及嗜酸性變減輕。
　　 2.各組各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)肝功能顯示，ALF組和ETT組血清ALT、AST水平在造模后6h開始升高(766.4±148.9，904.5±65.7)，于12h達(dá)高峰，分別為3152.2±341.0U/L和3232.8±372.0 U/L，明顯高于健康對(duì)照組31.0±5.6 U/L和37.2±6.0 U/L，與健康對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異; ETT組上述指標(biāo)水平升高幅度明顯低于

7、ALF組，與ALF組同一時(shí)間點(diǎn)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 3.ETT組大鼠血清TNF-a、IL-6水平雖高于健康對(duì)照組，但明顯低于ALF組。
　　 4.ALF組大鼠肝組織OX40mRNA表達(dá)上升，于造模后12h升高最明顯(3.118±0.391)，之后逐漸下降(24h1.977±0.282)。ETT組大鼠肝組織各時(shí)間點(diǎn)OX40mRNA表達(dá)水平高于正常對(duì)照組(0.990±0.119)，但較ALF組低，兩組相比，差異具備

8、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.各組大鼠肝組織Western blot結(jié)果顯示，隨著肝衰竭的進(jìn)展OX40蛋白的表達(dá)量逐漸增高，于12h達(dá)峰值(0.804±0.067)，24小時(shí)開始下降(0.661±0.057)。ETT組OX40蛋白表達(dá)水平較ALF組降低，各時(shí)間點(diǎn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.OX40在正常SD大鼠中有少量表達(dá);
　　 2.ALF組大鼠肝組織OX40表達(dá)隨著肝衰竭的進(jìn)展表達(dá)水平