AQP-9、MMP-9及TIMP-1在內(nèi)毒素致幼年大鼠腦水腫中的表達(dá)及意義.pdf

1、腦水腫(brain edema,BE)是指腦組織內(nèi)含水量的增高,主要包括血管源性腦水腫(vasogenic brain edema,VBE)和細(xì)胞毒性水腫(cytotoxic brain edema,CBE)<'[1]>.可在多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)疾病中發(fā)生和存在,其嚴(yán)重程度及發(fā)展變化過程決定疾病的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后.感染性腦水腫(infectiousbrain edema,IBE)是嚴(yán)重感染過

2、程中發(fā)生的由CBE和VBE組成的混合性腦水腫,嬰幼兒因生理特點(diǎn)由G￣細(xì)菌引起的CNS感染相當(dāng)常見,G￣細(xì)菌產(chǎn)生的脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)在IBE的發(fā)生與發(fā)展中具有重要作用,但其發(fā)生發(fā)展的確切機(jī)制尚未完全闡明. 水通道蛋白(aquaporins,AQPs)是一類存在于細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)囊泡中介導(dǎo)水通透的蛋白質(zhì)分子,AQP-9是其重要一員,已有研究發(fā)現(xiàn)AQP-9在腦缺血及腦出血性腦水腫的形成中起重要作用<'[2,3

3、]>,但其在感染性腦水腫的作用尚未見報(bào)道. 基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)為基質(zhì)金屬蛋白酶家族(matrix metalloproteinases,MMPs)重要成員,主要參與細(xì)胞外基質(zhì)(excetralcellular matrix,ECM)降解,組織型金屬蛋白酶抑制劑-1(tissue inhibitor ofmetalloproteinase-1,TIMP-1)為其特

4、異性內(nèi)源性抑制劑,二者的平衡在維持血腦屏障(blood-brain barrier BBB)的完整性方面起重要作用,已有研究發(fā)現(xiàn)MMP-9及TIMP-1 在腦出血、腦缺血、腦外傷、腦腫瘤等導(dǎo)致的腦水腫中起重要作用,但二者在感染性腦水腫的作用報(bào)道甚少. 本實(shí)驗(yàn)通過注射LPS制作大鼠IBE模型,對不同時(shí)間點(diǎn)的腦組織病理學(xué)改變、腦組織含水量(brain edema content,BWC)及伊文思藍(lán)(Evans blue,EB)含量進(jìn)

5、行研究;同時(shí)應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)及逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)技術(shù)(reversetranscription-polymerase chain reaction,RT-PCR)測定不同時(shí)間點(diǎn)AQP-9、MMP-9和TIMP-1三者蛋白和mRNA動(dòng)態(tài)表達(dá)變化,并對有關(guān)指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,旨在初步探討三者在IBE發(fā)生和發(fā)展中的可能作用,為臨床認(rèn)識(shí)及防治BE提供實(shí)驗(yàn)依據(jù). 材料與方法 健康1月齡普通級SD大鼠128只,雌雄不限,體重70

6、g～100g,隨機(jī)分為兩組.LPS組(實(shí)驗(yàn)組):64只,頸內(nèi)動(dòng)脈注射LPS(1mg/kg),NS組(對照組):64只,頸內(nèi)動(dòng)脈注射等量生理鹽水;兩組按觀察時(shí)間點(diǎn)分別再分為6h、12h、24h和48h 4個(gè)亞組,每亞組均為16只.上述各組有8只不注射EB以進(jìn)行免疫組化染色.注射EB組隨后經(jīng)右頸外靜脈近心端注入2﹪EB(2ml/kg),推注時(shí)間lmin～2min.各組處理后,分別于6h、12h、24h、48h處死,制備腦組織標(biāo)本.采用干濕重

7、法測定不同時(shí)間點(diǎn)BWC,甲酰胺法測定腦組織EB含量,免疫組織化學(xué)法檢測BE不同時(shí)間段AQP-9,MMP-9和TIMP-1蛋白的表達(dá)及RT-PCR技術(shù)檢測AQP-9,MMP-9和TIMP-1 mRNA的表達(dá).所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,顯著性水準(zhǔn)a=0.05. 結(jié)果 1形態(tài)學(xué):與NS組相比,LPS組HE染色光鏡下可見血管周圍問隙增寬、炎性細(xì)胞浸潤、膠質(zhì)細(xì)胞體積增大腫脹、神經(jīng)元空泡變性、細(xì)胞核固縮、等改變

8、. 2 BWC和腦組織EB含量:LPS組在6h,BWC和EB含量已經(jīng)開始增加,12h達(dá)高峰,48h仍高于NS組,各時(shí)間點(diǎn)均較NS組高(p<0.05). 3腦組織AQP-9蛋白及mRNA:注射后6h,LPS組腦組織AQP-9及mRNA表達(dá)即上調(diào),于12h達(dá)高峰,隨后表達(dá)逐漸減少,48h仍高于NS組(p<0.05). 4 MMP-9和TIMP-1蛋白及mRNA:注射LPS后6h,腦組織MMP.9和TIMP-1蛋白及m

9、RNA表達(dá)已上調(diào),于12h～24h達(dá)高峰,48h仍維持在高水平,與NS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05).5 MMP-9/TIMP-1蛋白比值及MMP-9/TIMP-1mRNA比值表達(dá)變化:注射LPS后6 h, 二組比值已開始升高,于12h～24 h達(dá)高峰,48h仍維持在高水平,與NS組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05).6相關(guān)性分析:BWC和EB含量,AQP-9mRNA與BWC,AQP-9mRNA與EB含量, AQP-9蛋白

10、與AQP-9mRNA, AQP-9蛋白與 BWC,MMP-9mRNA/TIMP-1 mRNA比值與EB含量,MMP-9mRNA/TIMP-1 mRNA比值與BWC,MMP-9mRNA與MMP-9蛋白,TIMP-1mRNA與TIMP-1蛋白,MMP-9蛋白/TIMP-1蛋白比值與BWC之間均呈正相關(guān),r值分別是0.455,0.475,0.363,0.807,0.530,0.352,0.396,0.617,0.509和0.536,p<0.0

11、5.結(jié)論1經(jīng)幼年大鼠頸內(nèi)動(dòng)脈注射LPS可以建立起穩(wěn)定、可靠的IBE實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型.2在LPS所致大鼠IBE模型中,AQP-9蛋白及mRNA表達(dá)上調(diào),提示AQP-9可能參與了IBE的發(fā)生和發(fā)展.3在LPS所致大鼠IBE模型中,MMP-9和TIMP-1蛋白及其mRNA表達(dá)上調(diào),MMP-9/TIMP-1蛋白及mRNA比值明顯升高,提示二者尤其是二者的比值失衡可能在IBE的形成和發(fā)展過程中起重要作用.4在LPS所致大鼠IBE模型中,BWC和EB含