內(nèi)毒素的檢測及意義

1、內(nèi)毒素培訓(xùn),--吳賢鋒,,內(nèi)毒素的基礎(chǔ)知識,儀器試劑的簡單介紹及實驗原理,臨床檢驗關(guān)心的問題,三大知識點,,1892年,科學(xué)家Richard在研究霍亂弧菌的時候,發(fā)現(xiàn)革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中有一種不溶性成分,它能夠引起人體發(fā)熱、休克、器官損害等病理表現(xiàn)，因其毒性效應(yīng)和性質(zhì)與外毒素有顯著差異，就用內(nèi)毒素這一術(shù)語來描述該物質(zhì)。隨后多年對革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的超微結(jié)構(gòu)技術(shù)和生物分析技術(shù)，證實內(nèi)毒素是磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)。,內(nèi)毒素發(fā)現(xiàn)的歷史,內(nèi)毒素的

2、組成,,,,O–特異性抗原,脂質(zhì)A,核心多糖,,,內(nèi)毒素的定義和危害,,內(nèi)毒素（Endotoxin）是革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜的脂多糖（LPS）成分，是革蘭陰性菌生長時釋放或死亡后裂解出來的毒性產(chǎn)物，其中起主要致病作用的是非結(jié)合的游離脂多糖（FLPS）。,內(nèi)毒素能夠直接作用于人體，激活組織內(nèi)的炎性細(xì)胞和炎癥因子，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)熱并產(chǎn)生全身性炎癥反應(yīng)，繼而引起彌散性血管內(nèi)凝血、休克、多臟器功能衰竭等嚴(yán)重的病理生理癥狀，危及生命。,定義,危害,內(nèi)毒

3、素的理化性質(zhì),,可濾過性：能夠穿透濾過膜,水 溶 性：LPS的O-特異性Ag呈親水性,被吸附性：可被活性碳所吸附,易被強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和強(qiáng)氧化劑破壞,耐 熱 性：徹底滅活需250高溫干烤一小時,,人體內(nèi)毒素的來源,內(nèi)源性途徑,外源性途徑,注射藥品及溶液,開放性創(chuàng)傷,燒傷,骨折,感染,休克,大手術(shù)術(shù)后,肝臟疾病,儀器試劑的介紹及實驗原理,BET-24A細(xì)菌內(nèi)毒素分析儀 天津大學(xué)天大天發(fā)科技有限公司生產(chǎn),人體液檢測專用鱟試劑盒

4、 湛江博康海洋生物制品有限公司生產(chǎn),鱟,20世紀(jì)六十年代，人們發(fā)現(xiàn)一種古老的海洋生物，被稱為“海洋活化石”的鱟，它的血液與內(nèi)毒素接觸后會發(fā)生特異性的凝集反應(yīng)，人們經(jīng)過大量研究和實驗從它的血液中提取出了用來檢測內(nèi)毒素的“鱟試劑”。,,鱟試劑的發(fā)明,1968年1月Jack Levin和 Frederik B.Bang教授在美國馬塞諸塞州Wools Hole海洋生物實驗室成功分離提取鱟血細(xì)胞并研制成能夠檢測細(xì)菌內(nèi)毒素的鱟試劑，開辟了人類認(rèn)識和

5、檢測內(nèi)毒素的新紀(jì)元！,試劑盒特點,鱟試劑是唯一能夠檢測內(nèi)毒素水平的生物試劑,采用更為準(zhǔn)確的動態(tài)濁度法進(jìn)行檢測,鱟試劑盒由鱟試劑、I號II號檢測前處理液、除菌除熱原試管和采血管、吸頭及檢測用水組成,精心設(shè)置血液前處理流程，有效去除血細(xì)胞和蛋白的干擾，準(zhǔn)確評估待測樣本中的內(nèi)毒素水平,采用內(nèi)毒素國家工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行質(zhì)控測評，保證檢測結(jié)果準(zhǔn)確無誤,采用國際通用的內(nèi)毒素活性單位（EU/ml）來準(zhǔn)確衡量待測樣本中的內(nèi)毒素致病效能,內(nèi)毒素的單位—EU/

6、ml,,實驗原理,通過鱟試劑與內(nèi)毒素溶液混合會發(fā)生凝集反應(yīng)產(chǎn)生濁度變化，通過濃度—時間反應(yīng)曲線，得出待測樣品的內(nèi)毒素濃度；,實驗原理,實驗原理,鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)是特異性的“S”曲線，取光密度值為0.02點時作為反應(yīng)終點時間，內(nèi)毒素的濃度與反應(yīng)時間成反比,BET檢測標(biāo)本范圍,,腹腔積液,,檢測內(nèi)毒素的方法,定性檢測,,,,,,,,,凝膠法,,,,,,,,定量檢測,光度（濁度）法,顯色（比色）法,動態(tài)濁度法,終點濁度法,動態(tài)顯色法,終點顯

7、色法,,,幾種檢測方法的比較,凝膠法檢測的特點“限量”檢測，是一種傳統(tǒng)經(jīng)典的檢測方法；凝膠法是以試管內(nèi)反應(yīng)物凝膠牢固程度為判斷標(biāo)準(zhǔn)，易受人為因素影響；限量檢查的最低檢測限僅為0.035EU/ml，因供試品稀釋倍數(shù)所限，容易被供試品干擾，誤差大。因此，凝膠法不適合在臨床用于體液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查；,顯色法檢測的特點顯色基質(zhì)法系利用鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中產(chǎn)生的凝固酶使特定底物顯色釋放出的呈色團(tuán)的多少而測定內(nèi)毒素含量的方法，根據(jù)產(chǎn)物顏

8、色判斷內(nèi)毒素濃度。 此法試劑較昂貴，操作較復(fù)雜，在一定范圍之內(nèi)靈敏度、特異性較高，但檢測范圍窄；,動態(tài)濁度法檢測的特點,,,動態(tài)濁度法檢測的特點,利用細(xì)菌內(nèi)毒素在與鱟試劑形成凝膠過程中濁度動態(tài)變化定量測定細(xì)菌內(nèi)毒素水平,動態(tài)濁度法法檢測范圍寬，檢測范圍為 0.005EU/ml 100EU/ml，應(yīng)用范圍廣,對樣本的內(nèi)毒素含量可以定量檢測，標(biāo)準(zhǔn)化程度高，適合用于臨床體液細(xì)菌內(nèi)毒素引起發(fā)熱及重癥疾病的早期診斷檢測,,,,,,

9、,發(fā)熱原因的快速輔助診斷（< 1小時）,內(nèi)毒素定量檢測的臨床意義,早期判斷革蘭陰性菌的感染情況,（Gˉ菌所致）重癥疾患的早期診斷,幫助臨床醫(yī)生快速合理篩選適當(dāng)?shù)目股?判斷抗感染治療效果及預(yù)后,腸源性內(nèi)毒素血癥的預(yù)判及評估,,,,,惡性腫瘤,感染,結(jié)締組織,,,Gˉ,G+,發(fā)熱,發(fā)熱原因的快速輔助診斷,,病毒,真菌等,細(xì)菌,,,,,,,,,,,,,幫助臨床醫(yī)生快速篩選合理抗生素,Gˉ,,內(nèi)毒素,氨基糖甙類,,第82回日本泌尿器科學(xué)

10、會 1994.4,,,內(nèi)毒素檢測與微生物培養(yǎng)的關(guān)系,,,,內(nèi)毒素與血培養(yǎng)的結(jié)果比較,內(nèi)毒素超標(biāo),血培養(yǎng)陽性,,,內(nèi)毒素與痰培養(yǎng)的結(jié)果比較,,BET和PCT(降鈣素原)的區(qū)別,PCT本身無致病作用，而LPS能直接導(dǎo)致人體發(fā)熱及產(chǎn)生炎癥反應(yīng),PCT也是在以LPS為首的炎癥因子作用下刺激機(jī)體靶細(xì)胞產(chǎn)生,PCT僅能判斷是否是細(xì)菌感染，BET能判斷是否為Gˉ菌感染，檢測更精準(zhǔn),對于某些腫瘤患者、新生兒及接受移植手術(shù)患者而言，如感染則檢測PCT有制

11、約，而BET對此毫無制約,分段區(qū)間的解釋,0～0.035EU/ml 無明顯內(nèi)毒素血癥,0.035 ～ 0.1EU/ml 臨床觀察期,0.1 ～ 1.0EU/ml 內(nèi)毒素血癥,大于1.0EU/ml 重度內(nèi)毒素血癥,,,,,,BET測得值的影響因素有那些,外源性的內(nèi)毒素侵入,患者肝功能,血細(xì)胞及免疫系統(tǒng),患者腸道的屏障功能,Gˉ感染及使用抗生素殺滅Gˉ內(nèi)毒素的釋放,內(nèi)毒素血癥的預(yù)防和治療