內毒素的測定

1、主要內容,內毒素的來源及結構內毒素的生物學活性內毒素檢測的臨床應用內毒素的檢測方法及參考范圍檢測樣本的采集及影響因素,內毒素概述,內毒素是革蘭氏陰性細菌細胞壁結構中的脂多糖（LPS），這些成分只在細菌死亡裂解后才釋放到菌體外或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。,,特異性多糖,核心多糖,類脂A,內毒素的結構,內毒素的生物學活性,內毒素的生物學活性,,,內毒素的有益作用,,,,內毒素血癥產(chǎn)生原因,有效的抗菌治療后，細菌崩解,,輸入了含有細菌的

2、藥物、血液或者體液等。,內毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對內毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發(fā)熱，白細胞數(shù)變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以及休克、血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。,內毒素血癥的臨床癥狀,,最嚴重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率極高。,肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、燒傷85%、急性胰腺炎90%、敗血癥70%、急性肝炎37-64%、暴發(fā)

3、性肝炎58-100%、丙肝61.54%、膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%、多器官功能衰竭100%。,各類疾病內毒素血癥的發(fā)生率,內毒素檢測的臨床應用,內毒素檢測在醫(yī)院中的應用,鱟試驗是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鱟的變形細胞與微量內毒素產(chǎn)生凝集反應的現(xiàn)象，作為判斷試品中細菌內毒素含量的一種方法。,內毒素的檢測方法,內毒素的檢測原理,革蘭陰性菌脂多糖（內毒素）檢測原理：革蘭陰性菌脂多糖（內毒素）激活酶反應主劑中的相

4、應因子后形成凝固蛋白， 根據(jù)其引起的濁度變化對革蘭氏陰性菌脂多糖（內毒素）濃度進行定量測定。,內毒素的檢測原理,G,G,內毒素的檢測方法,鱟試劑（Limulus amebocyte lysate LAL),內毒素檢測的參考值,檢測值﹤10pg/ml,陰性。檢測值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥20pg/ml，陽性，建議再次采血以確診。,肝炎 敗血癥 腫瘤 內

5、毒素濃度 50-320 20-1000 20-700,檢測樣本的采集及影響因素,檢測樣本：血液采集要求：采樣過程要求無菌操作，用專用的無熱原真空采血管。常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血/取樣（血透患者透析前采血）。樣本保存：樣本采集后應在3000轉/分進行離心，若不能及時檢測，應將血漿轉移至無熱原轉移管內，在-30℃冰箱中冷凍保存，一周內使用。特殊標本處理 ：對一般黃疸、溶血、乳糜血標本，稀釋2~5倍后進行檢測

6、 ；對于嚴重的黃疸、溶血、乳糜血標本，應重新采血。,影響結果的因素,產(chǎn)生假陽性的原因有：操作環(huán)境及操作過程中污染，應用某些抗生素類如?-酰胺內酯類、喹喏酮類等患者。,,,MB-80微生物快速動態(tài)檢測系統(tǒng),(1-3)-?-D-葡聚糖,侵襲性真菌感染的定義,,,定義: 指致病性真菌侵犯皮 下組織、黏膜、肌肉和內臟器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性較大。,條件致病性真菌念珠菌屬曲霉屬其他,,侵襲性真菌感染的特點,,,,1. 不

7、產(chǎn)生內毒 素和外毒素 致病機理不明,4. 早期癥狀無特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高,2. 致病力一般 較弱，機體免 疫低下時發(fā)生,3. 感染菌種變化， 白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增長趨勢上升明顯,侵襲性真菌感染（IFI）現(xiàn)狀,IFI發(fā)生率不斷增加； IFI感染病死率很高； IFI診斷困難及漏診情況嚴重。,1.內源性誘因,2.外源性誘因,影響機體抵抗力的各種疾病，如白血病、癌癥、結核、肺

8、膿腫、糖尿病、肝臟疾病以及維生素缺乏等,,廣譜抗生素，抗腫瘤藥物和免疫抑制劑；,插管等侵襲性治療，骨髓和實體器官移植；,免疫缺陷綜合癥,侵襲性真菌感染的誘因,國內侵襲性真菌感染不容忽視,劉正印等，中華醫(yī)學雜志2003,83(5):399-402,,感染人數(shù),國內侵襲性真菌感染不容忽視,,臨床藥物治療雜志 2007年第5卷第1期,感染率(%),中國感染與化療雜志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期,,尸檢研究發(fā)現(xiàn)，75%的侵襲性

9、真菌感染病例在生前漏診,診斷困難的主要原因： --- 臨床表現(xiàn)不典型，易被基礎疾病所掩蓋 --- 確診常需侵入性手段獲得組織標本，侵入性操作常因患者 的病情所限難以實施--- 真菌檢測項目開展相對不足或滯后,IFI診斷困難及漏診情況嚴重,主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病,,肺炎肺纖維癥,腦出血腦梗塞硬膜下血瘤術后胸部大動脈瘤術后,糖尿病,再生障礙性貧血MODSDIC,胃癌，肝癌，肝內膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓

10、瘤，白血病，惡性淋巴瘤,肺結核腹腔內膿腫AIDS,呼吸系統(tǒng)疾病,感染及寄生蟲病,循環(huán)系統(tǒng)疾病,內分泌疾病,血液及造血器官疾病,腫瘤類,侵襲性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的發(fā)病率逐年上升,其中又以侵襲性肺部真菌感染( invasive pulmonary fungal infection, IPF I) 最常見,大約占50%～60%。未經(jīng)及時治療的肺部真菌感染患者的病死率可高達3

11、0% ～80% 。,侵襲性肺部真菌感染,臨床表現(xiàn)：缺乏特異性,多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咯血、胸悶、呼吸困難等。,現(xiàn) 狀：兩高兩低一快檢測方法相對滯后,早期診斷和治療仍存在困難,副作用小的 新型抗真菌藥物價格昂貴,導致病死率高。,高院內感染率和病死率低臨床和實驗室診斷率 患者病情惡化快,侵襲性肺部真菌感染,死亡率(%),診斷延遲時間 (h),ICU診斷延遲時間與死亡率的關系,11,33,30,3

12、5,Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:3640–3645.,美國四大醫(yī)療中心做的一項回顧性研究,死亡率(%),診斷延遲時間(d),Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:25–31 .,,,,,β1,3,真菌細胞膜、壁結構,,羊毛固醇C－14去甲基化酶14位還原和7－8位異構酶角鯊烯環(huán)氧化酶,,1-3-β-D-葡聚糖本

13、質及特點,(1-3)-β-D-葡聚糖特性,對熱極為穩(wěn)定，高壓121℃并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細胞壁中含量較多，對G試驗靈敏。,,當真菌進入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可從胞壁中釋放出來，從而使血液及其它體液中含量增高。當真菌在體內含量減少時，機體免疫系統(tǒng)可將其清除。,,在淺部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被釋放出來，故其在體液中的量不增高。,“G”試驗緣何而來

14、？,,1-3-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗。,內毒素與β-葡聚糖的檢測比較,已知能與鱟試劑發(fā)生反應的物質有細菌內毒素和β-葡聚糖，但它們的反應曲線不一樣。內毒素反應曲線為S型特征曲線，而β-葡聚糖反應曲線為經(jīng)過0點的斜線。,內毒素和β-葡聚糖與鱟試劑反應的特征曲線,侵襲性真菌感染的臨床檢測方法對比,,,,科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色：,熱帶念珠菌----灰藍色白色念珠菌 ----

15、綠色克柔念珠菌----粉紅色光滑念珠菌----紫紅色其他念珠菌----白色,科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色： A/E--白色假絲酵母菌，B/C-克柔假絲酵母菌，F(xiàn)--光滑假絲酵母菌，D-熱帶假絲酵母菌,?-D-葡聚糖的評價,可檢測多種致病真菌感染 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，鐮刀菌，地霉，組織胞漿菌， 毛孢子菌等不能檢測隱球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁頭霉等）敏感性、特異性：90％左右,對于念珠菌血癥, G試驗

16、檢測是首選檢查 J. Clin. Microbiol. 2008.46:1009–1013.,BG值在IFI臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已經(jīng)高于正常值 Pazos等報道5例確診IFI及3例臨床診斷的IFI患者，發(fā)現(xiàn)BG值升高出現(xiàn)在發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀和肺部HRCT檢查發(fā)現(xiàn)以前 。 平均早于發(fā)熱

17、5 d 早于呼吸道癥狀平均10.7 d J Clin Microbiol，2005，43(1)：299—305,G試驗檢測評價,Odabasi等對確診為粒細胞缺乏人群進行為期3周每周2次采血

18、檢測及臨床觀察發(fā)現(xiàn)：BG值開始高于60 pg／ml的時間比最后確診為IFI或臨床診斷IFI平均提前了10 d Clin Infect Dis，2004，39(2)：199—205,G試驗檢測評價,?-D-葡聚糖參考值,檢測值﹤10pg/ml,陰性

19、。檢測值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動態(tài)采血檢測。檢測值﹥20pg/ml，陽性(深部真菌感染)，建議再次采血以確診。,關于G試驗建議,G試驗臨床應用 1　明確診斷　　（抗真菌藥物治療前）　2　治療效果監(jiān)測　?。拐婢幬镏委熀螅?　連續(xù)2次采血進行G試驗,標本采集及保存,,臨床細菌內毒素及(1-3)-?-D-Glucan檢測的國內外發(fā)展,國外：血液（包括血漿、腦脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁

20、等）中內毒素以及(1-3)-?-D-Glucan微量定量檢測已經(jīng)成為現(xiàn)實，目前在美國、日本等國均已出現(xiàn)專用細菌內毒素及(1-3)-?-D-Glucan檢測儀器及配套的檢測試劑盒，而且獲得FDA及厚生省批準文號，作為一種日常檢測項目。國內：MB-80 檢測系統(tǒng)，為國內獨家研制和生產(chǎn)的檢測臨床內毒素及(1-3)-?-D-Glucan的專用儀器，同時具有配套的檢測試劑盒 EKT-5Mset and GKT-%M set　獲得SDA批準文號,