內(nèi)毒素的測(cè)定

1、主要內(nèi)容,內(nèi)毒素的來(lái)源及結(jié)構(gòu)內(nèi)毒素的生物學(xué)活性內(nèi)毒素檢測(cè)的臨床應(yīng)用內(nèi)毒素的檢測(cè)方法及參考范圍檢測(cè)樣本的采集及影響因素,內(nèi)毒素概述,內(nèi)毒素是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)中的脂多糖（LPS），這些成分只在細(xì)菌死亡裂解后才釋放到菌體外或活菌以發(fā)泡形式將其釋出。,,特異性多糖,核心多糖,類脂A,內(nèi)毒素的結(jié)構(gòu),內(nèi)毒素的生物學(xué)活性,內(nèi)毒素的生物學(xué)活性,,,內(nèi)毒素的有益作用,,,,內(nèi)毒素血癥產(chǎn)生原因,有效的抗菌治療后，細(xì)菌崩解,,輸入了含有細(xì)菌的

2、藥物、血液或者體液等。,內(nèi)毒素血癥臨床癥狀主要決定于宿主對(duì)內(nèi)毒素的抵抗力。癥狀和體征有：發(fā)熱，白細(xì)胞數(shù)變化，出血傾向，心力衰竭、腎功能減退、肝臟損傷、神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，以及休克、血壓下降、組織灌流不足、缺氧及酸中毒等。,內(nèi)毒素血癥的臨床癥狀,,最嚴(yán)重的后果：致死性感染性休克，多器官功能衰竭，DIC等。病死率極高。,肺炎100%、尿路感染70-80%、腹腔感染72-84%、燒傷85%、急性胰腺炎90%、敗血癥70%、急性肝炎37-64%、暴發(fā)

3、性肝炎58-100%、丙肝61.54%、膽石癥伴急性梗阻性化膿性感染85%、多器官功能衰竭100%。,各類疾病內(nèi)毒素血癥的發(fā)生率,內(nèi)毒素檢測(cè)的臨床應(yīng)用,內(nèi)毒素檢測(cè)在醫(yī)院中的應(yīng)用,鱟試驗(yàn)是1968年由Levin和Bang建立。其原理是利用鱟的變形細(xì)胞與微量?jī)?nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的現(xiàn)象，作為判斷試品中細(xì)菌內(nèi)毒素含量的一種方法。,內(nèi)毒素的檢測(cè)方法,內(nèi)毒素的檢測(cè)原理,革蘭陰性菌脂多糖（內(nèi)毒素）檢測(cè)原理：革蘭陰性菌脂多糖（內(nèi)毒素）激活酶反應(yīng)主劑中的相

4、應(yīng)因子后形成凝固蛋白， 根據(jù)其引起的濁度變化對(duì)革蘭氏陰性菌脂多糖（內(nèi)毒素）濃度進(jìn)行定量測(cè)定。,內(nèi)毒素的檢測(cè)原理,G,G,內(nèi)毒素的檢測(cè)方法,鱟試劑（Limulus amebocyte lysate LAL),內(nèi)毒素檢測(cè)的參考值,檢測(cè)值﹤10pg/ml,陰性。檢測(cè)值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動(dòng)態(tài)采血檢測(cè)。檢測(cè)值﹥20pg/ml，陽(yáng)性，建議再次采血以確診。,肝炎 敗血癥 腫瘤 內(nèi)

5、毒素濃度 50-320 20-1000 20-700,檢測(cè)樣本的采集及影響因素,檢測(cè)樣本：血液采集要求：采樣過(guò)程要求無(wú)菌操作，用專用的無(wú)熱原真空采血管。常規(guī)病人早上用藥治療前空腹采血/取樣（血透患者透析前采血）。樣本保存：樣本采集后應(yīng)在3000轉(zhuǎn)/分進(jìn)行離心，若不能及時(shí)檢測(cè)，應(yīng)將血漿轉(zhuǎn)移至無(wú)熱原轉(zhuǎn)移管內(nèi)，在-30℃冰箱中冷凍保存，一周內(nèi)使用。特殊標(biāo)本處理 ：對(duì)一般黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，稀釋2~5倍后進(jìn)行檢測(cè)

6、 ；對(duì)于嚴(yán)重的黃疸、溶血、乳糜血標(biāo)本，應(yīng)重新采血。,影響結(jié)果的因素,產(chǎn)生假陽(yáng)性的原因有：操作環(huán)境及操作過(guò)程中污染，應(yīng)用某些抗生素類如?-酰胺內(nèi)酯類、喹喏酮類等患者。,,,MB-80微生物快速動(dòng)態(tài)檢測(cè)系統(tǒng),(1-3)-?-D-葡聚糖,侵襲性真菌感染的定義,,,定義: 指致病性真菌侵犯皮 下組織、黏膜、肌肉和內(nèi)臟器官等所引起的真菌感染性疾病，危害性較大。,條件致病性真菌念珠菌屬曲霉屬其他,,侵襲性真菌感染的特點(diǎn),,,,1. 不

7、產(chǎn)生內(nèi)毒 素和外毒素 致病機(jī)理不明,4. 早期癥狀無(wú)特異性，往往被原發(fā)病掩蓋，病程長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)較晚，死亡率高,2. 致病力一般 較弱，機(jī)體免 疫低下時(shí)發(fā)生,3. 感染菌種變化， 白色念珠菌感染下降，曲霉菌感染增長(zhǎng)趨勢(shì)上升明顯,侵襲性真菌感染（IFI）現(xiàn)狀,IFI發(fā)生率不斷增加； IFI感染病死率很高； IFI診斷困難及漏診情況嚴(yán)重。,1.內(nèi)源性誘因,2.外源性誘因,影響機(jī)體抵抗力的各種疾病，如白血病、癌癥、結(jié)核、肺

8、膿腫、糖尿病、肝臟疾病以及維生素缺乏等,,廣譜抗生素，抗腫瘤藥物和免疫抑制劑；,插管等侵襲性治療，骨髓和實(shí)體器官移植；,免疫缺陷綜合癥,侵襲性真菌感染的誘因,國(guó)內(nèi)侵襲性真菌感染不容忽視,劉正印等，中華醫(yī)學(xué)雜志2003,83(5):399-402,,感染人數(shù),國(guó)內(nèi)侵襲性真菌感染不容忽視,,臨床藥物治療雜志 2007年第5卷第1期,感染率(%),中國(guó)感染與化療雜志2008 年7 月20 日第 8 卷第4 期,,尸檢研究發(fā)現(xiàn)，75%的侵襲性

9、真菌感染病例在生前漏診,診斷困難的主要原因： --- 臨床表現(xiàn)不典型，易被基礎(chǔ)疾病所掩蓋 --- 確診常需侵入性手段獲得組織標(biāo)本，侵入性操作常因患者 的病情所限難以實(shí)施--- 真菌檢測(cè)項(xiàng)目開(kāi)展相對(duì)不足或滯后,IFI診斷困難及漏診情況嚴(yán)重,主要可引發(fā)侵襲性真菌感染的疾病,,肺炎肺纖維癥,腦出血腦梗塞硬膜下血瘤術(shù)后胸部大動(dòng)脈瘤術(shù)后,糖尿病,再生障礙性貧血MODSDIC,胃癌，肝癌，肝內(nèi)膽管癌，肺癌，多發(fā)性骨髓

10、瘤，白血病，惡性淋巴瘤,肺結(jié)核腹腔內(nèi)膿腫AIDS,呼吸系統(tǒng)疾病,感染及寄生蟲(chóng)病,循環(huán)系統(tǒng)疾病,內(nèi)分泌疾病,血液及造血器官疾病,腫瘤類,侵襲性真菌感染( invasive fungal infection, IFI)的發(fā)病率逐年上升,其中又以侵襲性肺部真菌感染( invasive pulmonary fungal infection, IPF I) 最常見(jiàn),大約占50%～60%。未經(jīng)及時(shí)治療的肺部真菌感染患者的病死率可高達(dá)3

11、0% ～80% 。,侵襲性肺部真菌感染,臨床表現(xiàn)：缺乏特異性,多表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、咳痰、咯血、胸悶、呼吸困難等。,現(xiàn) 狀：兩高兩低一快檢測(cè)方法相對(duì)滯后,早期診斷和治療仍存在困難,副作用小的 新型抗真菌藥物價(jià)格昂貴,導(dǎo)致病死率高。,高院內(nèi)感染率和病死率低臨床和實(shí)驗(yàn)室診斷率 患者病情惡化快,侵襲性肺部真菌感染,死亡率(%),診斷延遲時(shí)間 (h),ICU診斷延遲時(shí)間與死亡率的關(guān)系,11,33,30,3

12、5,Morrell M et al. Antimicrob Agents Chemother 2005, 49:3640–3645.,美國(guó)四大醫(yī)療中心做的一項(xiàng)回顧性研究,死亡率(%),診斷延遲時(shí)間(d),Garey KW et al. Clin Infect Dis 2006, 43:25–31 .,,,,,β1,3,真菌細(xì)胞膜、壁結(jié)構(gòu),,羊毛固醇C－14去甲基化酶14位還原和7－8位異構(gòu)酶角鯊烯環(huán)氧化酶,,1-3-β-D-葡聚糖本

13、質(zhì)及特點(diǎn),(1-3)-β-D-葡聚糖特性,對(duì)熱極為穩(wěn)定，高壓121℃并不能使其滅活。在念珠菌和曲霉菌細(xì)胞壁中含量較多，對(duì)G試驗(yàn)靈敏。,,當(dāng)真菌進(jìn)入人體血液或深部組織后，經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬、消化等處理后，(1-3)-β-D-葡聚糖可從胞壁中釋放出來(lái)，從而使血液及其它體液中含量增高。當(dāng)真菌在體內(nèi)含量減少時(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)可將其清除。,,在淺部真菌感染中，(1-3)-β-D-葡聚糖未被釋放出來(lái)，故其在體液中的量不增高。,“G”試驗(yàn)緣何而來(lái)

14、？,,1-3-β-D-葡聚糖可特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解物中的G因子，引起裂解物凝固，故稱G試驗(yàn)。,內(nèi)毒素與β-葡聚糖的檢測(cè)比較,已知能與鱟試劑發(fā)生反應(yīng)的物質(zhì)有細(xì)菌內(nèi)毒素和β-葡聚糖，但它們的反應(yīng)曲線不一樣。內(nèi)毒素反應(yīng)曲線為S型特征曲線，而β-葡聚糖反應(yīng)曲線為經(jīng)過(guò)0點(diǎn)的斜線。,內(nèi)毒素和β-葡聚糖與鱟試劑反應(yīng)的特征曲線,侵襲性真菌感染的臨床檢測(cè)方法對(duì)比,,,,科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色：,熱帶念珠菌----灰藍(lán)色白色念珠菌 ----

15、綠色克柔念珠菌----粉紅色光滑念珠菌----紫紅色其他念珠菌----白色,科瑪嘉念珠菌顯色培養(yǎng)基的菌落顏色： A/E--白色假絲酵母菌，B/C-克柔假絲酵母菌，F(xiàn)--光滑假絲酵母菌，D-熱帶假絲酵母菌,?-D-葡聚糖的評(píng)價(jià),可檢測(cè)多種致病真菌感染 念珠菌，曲霉，肺孢子菌，鐮刀菌，地霉，組織胞漿菌， 毛孢子菌等不能檢測(cè)隱球菌、接合菌（根霉、毛霉、根毛霉、犁頭霉等）敏感性、特異性：90％左右,對(duì)于念珠菌血癥, G試驗(yàn)

16、檢測(cè)是首選檢查 J. Clin. Microbiol. 2008.46:1009–1013.,BG值在IFI臨床表現(xiàn)出現(xiàn)之前就已經(jīng)高于正常值 Pazos等報(bào)道5例確診IFI及3例臨床診斷的IFI患者，發(fā)現(xiàn)BG值升高出現(xiàn)在發(fā)熱、咳嗽、胸痛等癥狀和肺部HRCT檢查發(fā)現(xiàn)以前 。 平均早于發(fā)熱

17、5 d 早于呼吸道癥狀平均10.7 d J Clin Microbiol，2005，43(1)：299—305,G試驗(yàn)檢測(cè)評(píng)價(jià),Odabasi等對(duì)確診為粒細(xì)胞缺乏人群進(jìn)行為期3周每周2次采血

18、檢測(cè)及臨床觀察發(fā)現(xiàn)：BG值開(kāi)始高于60 pg／ml的時(shí)間比最后確診為IFI或臨床診斷IFI平均提前了10 d Clin Infect Dis，2004，39(2)：199—205,G試驗(yàn)檢測(cè)評(píng)價(jià),?-D-葡聚糖參考值,檢測(cè)值﹤10pg/ml,陰性

19、。檢測(cè)值介于10～20pg/ml之間，臨床觀察期，建議動(dòng)態(tài)采血檢測(cè)。檢測(cè)值﹥20pg/ml，陽(yáng)性(深部真菌感染)，建議再次采血以確診。,關(guān)于G試驗(yàn)建議,G試驗(yàn)臨床應(yīng)用 1　明確診斷　?。拐婢幬镏委熐埃?　治療效果監(jiān)測(cè)　?。拐婢幬镏委熀螅?　連續(xù)2次采血進(jìn)行G試驗(yàn),標(biāo)本采集及保存,,臨床細(xì)菌內(nèi)毒素及(1-3)-?-D-Glucan檢測(cè)的國(guó)內(nèi)外發(fā)展,國(guó)外：血液（包括血漿、腦脊液、血清、腹水液、尿液、唾液、乳汁

20、等）中內(nèi)毒素以及(1-3)-?-D-Glucan微量定量檢測(cè)已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)，目前在美國(guó)、日本等國(guó)均已出現(xiàn)專用細(xì)菌內(nèi)毒素及(1-3)-?-D-Glucan檢測(cè)儀器及配套的檢測(cè)試劑盒，而且獲得FDA及厚生省批準(zhǔn)文號(hào)，作為一種日常檢測(cè)項(xiàng)目。國(guó)內(nèi)：MB-80 檢測(cè)系統(tǒng)，為國(guó)內(nèi)獨(dú)家研制和生產(chǎn)的檢測(cè)臨床內(nèi)毒素及(1-3)-?-D-Glucan的專用儀器，同時(shí)具有配套的檢測(cè)試劑盒 EKT-5Mset and GKT-%M set　獲得SDA批準(zhǔn)文號(hào),