貝類毒素的測(cè)定

1、貝類毒素的測(cè)定 生物法,,一、麻痹性貝類毒素（PSP） Para1ytical shellfish poisoning,PSP中毒是最常見的食用貝類中毒PSP由一組石房蛤毒及其衍生物組成，PSP與渦鞭毛藻的水華有關(guān)（＞106個(gè)細(xì)胞／升）PSP在世界范圍內(nèi)分布 PSP中毒引起神經(jīng)系統(tǒng)紊亂，呼吸困難，感覺窒息，心肺衰竭而在2—24小時(shí)內(nèi)死亡一般PSP中毒在0.5-2h的時(shí)間內(nèi)，癥狀逐漸發(fā)展，能承受12h以上的

2、中毒者一般能康復(fù),麻痹性貝類毒素的測(cè)定方法,國(guó)際上麻痹性貝類毒素的檢測(cè)方法較多，主要有小白鼠法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法等。生物法(即小白鼠法)是國(guó)際慣用的麻痹性貝類毒素的測(cè)定方法，已被美國(guó)公職分析化學(xué)家協(xié)會(huì)《公定分析方法》（AOAO）收入，而成為最普遍應(yīng)用的檢驗(yàn)方法。生物法(即小白鼠法)，系采用ICR系列的小白鼠作為檢驗(yàn)動(dòng)物，進(jìn)行貝類毒素分析生物法(即小白鼠法)優(yōu)勢(shì)：當(dāng)使用生物法檢測(cè)法時(shí)，一旦發(fā)現(xiàn)超標(biāo)樣品，則本批

3、樣品不得食用，這說(shuō)明所檢測(cè)貝類中相關(guān)的毒素含量已經(jīng)影響到人們的食用安全，不適合食用。,麻痹性貝類毒素的測(cè)定　生物法 (SC/T 3023-2003),原理根據(jù)小鼠注射貝類提取液后的死亡時(shí)間，查出鼠單位，計(jì)算確定每100g貝肉中PSP的含量特點(diǎn)：測(cè)定結(jié)果代表存在于貝肉內(nèi)各種化學(xué)結(jié)構(gòu)的麻痹性貝類毒素的總量鼠單位 mouse unit，MU：對(duì)體重為20g的小白鼠腹腔注射1mL麻痹性貝類毒素后，小鼠在15min時(shí)死

4、亡所需的最低毒素量,試劑鹽酸溶液：0.1 mol/L鹽酸溶液：5 mol/L氫氧化鈉溶液：0.1 mol/L,儀器和設(shè)備均質(zhì)器天平（感量0.1g）離心機(jī)pH計(jì)秒表玻璃皿；燒杯、量筒、容量瓶、攪拌棒等注射器：1mL注射器針頭：8#,小白鼠： 體重為19-21g的健康ICR系雄性小白鼠 若體重＜19g或＞21g，查表中的校正系數(shù)便可得到校正的死亡時(shí)間 體重＞23g、或已用過(guò)的小白鼠則不能使用,樣品的測(cè)定,檢樣的制

5、備貝類 洗凈外殼，切斷閉殼肌，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來(lái)雜質(zhì)，仔細(xì)取貝肉，收集瀝水5min（避免貝肉堆積），撿出碎殼等雜物，將貝肉均質(zhì),注意：取肉時(shí)切勿割破肉體，開殼前不能加熱或用麻醉劑,樣品的測(cè)定,檢樣的制備貝類罐頭1.將罐內(nèi)所有內(nèi)容物（包括貝肉組織及汁液），于均質(zhì)器中均質(zhì)2.大容量的罐頭，則過(guò)濾分離貝肉及汁液，分別稱重，將固形物和湯汁按比例混合，充分均質(zhì)冷凍貝類 在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或脫殼的）呈

6、半冷凍狀態(tài)，按上述規(guī)定的方法清洗、開殼、淋洗、取肉、均質(zhì),樣品的測(cè)定,提取取100g樣品于800mL燒杯中，加0.1mol/L HCl溶液100mL充分?jǐn)嚢瑁瑱z查pH（pH應(yīng)為2.0-4.0）。需要時(shí)，可逐滴加入5mol/L HCl溶液或0.1mol/L NaOH溶液調(diào)整pH，加堿時(shí)速度要慢，同時(shí)需不斷攪拌，防止局部堿化破壞毒素,將混合物加熱，并徐徐煮沸5min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至2.0-4.0（切勿＞4.5）。將混合物移至量筒中

7、并稀釋至200mL,樣品的測(cè)定,提取將混合物倒回?zé)?，攪拌至均質(zhì)狀，使其沉降至上清液呈半透明狀，不能堵塞注射針頭即可必要時(shí)將混合物或上清液以3000r/min離心5min，或用濾紙過(guò)濾保留進(jìn)行小鼠注射用的足量液體（約10mL）,樣品的測(cè)定,小鼠試驗(yàn)選擇ICR系小鼠稱重：以感量為0.1g的天平將小鼠稱重并記錄重量,樣品的測(cè)定,小鼠試驗(yàn)每個(gè)樣品注射3只小鼠，每只小鼠腹腔注射1mL提取液。注射時(shí)若有一滴以上提取液溢出，須將該只小鼠

8、丟棄，并重新注射一只小鼠記錄注射完畢時(shí)間，仔細(xì)觀察 并用秒表記錄小鼠停止呼吸時(shí) 的死亡時(shí)間（到小鼠呼出最 后一口氣止）,樣品的測(cè)定,小鼠試驗(yàn)若注射樣品原液后，1只或2只小鼠的死亡時(shí)間大于7min，則需再注射至少3只小鼠以確定樣品的毒力若小鼠的死亡時(shí)間小于5min，則要稀釋樣品提取液后，再注射另一組小鼠（3只），得到5min-7min的死亡時(shí)間稀釋提取液時(shí)，要調(diào)節(jié)pH至2.0-4.0,逐滴加入0.1mol/L或0.01

9、mol/LHCl溶液,結(jié)果的計(jì)算與判斷,毒力的計(jì)算根據(jù)小鼠的死亡時(shí)間，在附錄B 中查出相應(yīng)的每毫升注射液的鼠單位數(shù)M 將存活鼠的死亡時(shí)間視為大于60min即相當(dāng)于＜0.875MU若試驗(yàn)動(dòng)物重量＜19g或＞21g。則根據(jù)附錄C查出重量校正系數(shù)k樣品中PSP的含量按公式（1）計(jì)算。……………（1） 式中： X—樣品中PSP含量，每百克樣品中鼠單位（MU / 100g） Ki—每只小鼠的重量校正系數(shù)

10、 Mi—每只小鼠的鼠單位數(shù)，鼠單位（MU） D—樣品提取液的稀釋倍數(shù) 200—樣品量，克（g）,,,,,結(jié)果的計(jì)算與判斷,毒力單位轉(zhuǎn)換樣品中的毒力單位的按公式（4）計(jì)算。F·80µg /100g＝400MU/100g ………（3） F=5式中： F—毒素轉(zhuǎn)換系數(shù)； 80µg /100g—樣品中PSP限量，µg /10

11、0g 400MU/100g—樣品中PSP限量，MU/100g,二、腹瀉性貝類毒素（DSP）Diarrhetic shellfish poisoning,DSP是由于雙殼貝類濾食含毒的渦鞭毛藻而引起影響較嚴(yán)重的地區(qū)主要是日本和歐洲沿海國(guó)家，發(fā)病率高，引起許多國(guó)家地區(qū)的關(guān)注受DSP中毒的癥狀表現(xiàn)為消化功能紊亂（腹瀉、嘔吐、腹痛），食用含毒貝類后30分鐘至幾小時(shí)出現(xiàn)癥狀，中毒者一般在3-4天康復(fù)，尚無(wú)死亡病例,腹瀉性貝類毒素的測(cè)定

12、方法,在國(guó)際上對(duì)腹瀉性貝類毒素的檢測(cè)方法較多，主要有生物法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫法、放射性免疫法等生物法（小白鼠法，Mouse bioassay）是最常用的一種方法,腹瀉性貝類毒素的測(cè)定 生物法(SC/T 3024-2004),原理用丙酮提取貝類中毒素，再轉(zhuǎn)移至乙醚中，經(jīng)減壓濃縮蒸干后，再以1%吐溫－60生理鹽水溶解殘留物，注射小白鼠觀察存活情況，計(jì)算其毒力試劑和材料丙酮（分析純）乙醚（分析純）1%吐溫-60生理鹽

13、水：稱取1.0g吐溫-60，溶于生理鹽水（0.8%NaCl）中，并定容至100.0mL,儀器和設(shè)備旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器均質(zhì)器磨口燒瓶：圓底，500 mL，250 mL，100 mL布氏漏斗：φ100mm分液漏斗：具塞，500 mL天平：感量0.1g刻度試管：10mL，具塞冰箱：0℃-5℃和-15℃- -20℃注射器：1mL注射器針頭：8#小白鼠：體重為16-20g的健康ICR系雄性小白鼠,檢樣的制備,生鮮帶殼的貝類用清水徹

14、底洗凈貝類外殼，開殼，用清水淋洗內(nèi)部去除泥沙及其他外來(lái)雜質(zhì)，仔細(xì)取出貝肉，切勿割破肉體收集貝肉，瀝水5min，撿出碎殼等雜物，迅速冷凍，貯藏備用注意不要破壞閉殼肌以外的組織，尤其是中腸腺（又稱消化盲囊，組織呈暗綠色或褐綠色）。開殼前不能加熱或用麻醉劑冷凍貝類在室溫下，使冷凍的樣品（帶殼或去殼的）呈半冷凍狀態(tài)，按上述方法清洗、開殼、淋洗、取肉,檢樣的制備,取 樣可以切取中腸腺的貝類（扇貝、貽貝、牡蠣等），稱取200g貝肉后，仔細(xì)

15、切取全部中腸腺，將中腸腺稱重后細(xì)切混合做為檢樣，注意不要使中腸內(nèi)容物污染案板 對(duì)于尚未確定部位毒性的貝類及不易切取中腸腺的小型貝肉，可將全部貝肉細(xì)切、混合，做為檢樣為避免毒素的危害，應(yīng)戴手套進(jìn)行檢驗(yàn)操作，移液管等用過(guò)的器材應(yīng)在5%的次氯酸鈉溶液中浸泡1h以上，以使毒素分解；廢棄的提取液等也應(yīng)用5%的次氯酸鈉溶液處理,提取,取處理好的中腸腺，或200g貝肉置于均質(zhì)杯內(nèi)，均質(zhì)2min加3倍量丙酮，與樣品充分?jǐn)嚢杈鶆蚝螅貌际下┒烦闉V并

16、收集提取液。對(duì)殘?jiān)詸z樣兩倍量丙酮再次抽濾兩次，合并抽濾液,提取,將抽提液移入500mL的磨口燒瓶中，減壓濃縮（旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，56℃）去除丙酮，直至在液體表面分離出油狀物將濃縮液移入分液漏斗內(nèi)，以100mL－200mL乙醚和少量的水洗下粘壁部分，輕輕振蕩(不能生成乳濁液)，靜置分層后，去除水層(下層)用相當(dāng)乙醚半量的蒸餾水洗乙醚層兩次，再將乙醚層移入250mL的磨口燒瓶中，減壓濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，35℃)去除乙醚,提取,以少量乙醚將濃縮

17、物移入100mL磨口燒瓶中，再次減壓濃縮去除乙醚以1%吐溫60生理鹽水將全部濃縮物在刻度試管中稀釋到10mL。此時(shí)1mL試液相當(dāng)于20g去殼貝肉的重量，以此懸浮液做為試驗(yàn)原液,小白鼠試驗(yàn),振蕩使試液或其稀釋液成為均勻的懸浮液將每只小白鼠稱重，每三只小白鼠為一組，分別將1mL試液注射到小白鼠腹腔中同時(shí)，另取三只小白鼠作為對(duì)照組，注射1mL 1%吐溫-60生理鹽水于腹腔中觀察自注射開始到24h后的小白鼠 存活情況，求出一組三只中