海洋聚醚類毒素基于適配體的檢測及生物合成的探索.pdf

1、海洋聚醚類毒素結(jié)構(gòu)新穎復雜，毒性強，穩(wěn)定性好，在全球分布廣泛。多來源于容易形成赤潮的有毒甲藻，通過食物鏈在貝類、魚類等海產(chǎn)品體內(nèi)富集，對于人類健康和海洋漁業(yè)造成了嚴重威脅。現(xiàn)有的毒素檢測方法都存在各種各樣的不足，因此急需新型的快速檢測聚醚類毒素的方法。此外，由于天然海洋聚醚類毒素提取困難，甲藻基因組又很難解析，因此目前對于毒素的生物合成了解的比較匱乏。
　　本課題以海洋聚醚類毒素中代表性的短裸甲藻毒素BTX、巖沙?？舅豍LTX和

2、大田軟海綿酸OA為研究對象，從毒素的檢測和生物合成兩方面展開研究，主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
　　1.海洋聚醚類毒素BTX適配體的篩選與應用。采用體外SELEX技術(shù)經(jīng)過18輪的篩選富集，分別獲得了與海洋聚醚類毒素BTX-A和BTX-B特異性結(jié)合的高親和力適配體A5和B2。通過先混合靶標篩選后分開次級文庫篩選的方式，一次性獲得了兩種毒素同系物的適配體，建立了一種高效篩選同系物適配體的SELEX方法。在此基礎(chǔ)上A5和B2這兩個適配體序列

3、進行了截短優(yōu)化和突變改造?；趍fold軟件對該適配體的二級結(jié)構(gòu)進行分析，截去A5引物區(qū)及5'端第一個莖環(huán)，并進一步進行了非必須核苷酸的去除和突變，獲得僅含有32個核苷酸的核心序列A5-S3G(Kd=72nM)。且不與STX、GTX、BTX-B、PLTX、OA等毒素結(jié)合，具有較好的特異性。通過生物素-鏈霉親合素耦合在線制備了基于SSA芯片和BLI技術(shù)的適配體傳感器，建立了基于生物膜干涉適配體傳感器檢測BTX的方法。最佳檢測時間250 s

4、，檢測范圍為100～2000 nM，最低檢測限4.5 nM(4 ng/ml)，且無交叉反應，同時具有較低的變異系數(shù)，可用于BTX-A的實驗室檢測。
　　2.海洋聚醚類毒素PLTX適配體的篩選與優(yōu)化。采用體外SELEX技術(shù)經(jīng)過10輪的篩選富集，通過序列同源比對聚類分析，結(jié)合生物膜干涉技術(shù)對篩選得到的若干適配體序列進行親和力表征，獲得了6條與海洋聚醚類毒素PLTX特異性結(jié)合的高親和力適配體，適配體P-13親和力最高（Kd=0.9 nM

5、）。在此基礎(chǔ)上，對P-5、P-13和P-18三條適配體序列進行了截短優(yōu)化。基于mfold二級結(jié)構(gòu)的分析，截去引物區(qū)及非必須核苷酸，獲得了2段與PLTX高親和力結(jié)合的核心序列，P-13S2(Kd=0.56 nM)和P-18S2(Kd=0.93nM)，為PLTX生物傳感器的制備奠定了基礎(chǔ)，提供了識別元件。將PLTX通過氨基偶聯(lián)到SPR CM5生物芯片表面，并用該芯片對優(yōu)化后的序列進行親和力表征，結(jié)合優(yōu)化后的序列及SPR技術(shù)，該芯片可用于制備

6、高靈敏的競爭法檢測PLTX的生物傳感器。
　　3.基于轉(zhuǎn)錄組測序的OA生物合成相關(guān)基因的挖掘。選取了初始氮濃度:磷濃度分別為15:1和30:1的培養(yǎng)條件培養(yǎng)利瑪原甲藻P.lima，培養(yǎng)不同時間收集藻細胞進行轉(zhuǎn)錄組測序和de novo拼接，得到了98594個Unigene，其平均長度為1319nt，N50為1856 nt。得到的轉(zhuǎn)錄本通過Nr數(shù)據(jù)庫、UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫、COG數(shù)據(jù)庫進行功能注釋及分類，通過

7、KEGG數(shù)據(jù)庫進行相關(guān)代謝途徑注釋，其中73289個Unigene成功注釋到功能，注釋到333條代謝途徑。在此基礎(chǔ)上初步確定了代謝途徑中基因的上調(diào)及下調(diào)水平。最后利用RSEM計算每個轉(zhuǎn)錄本的RPKM值，并對相關(guān)代謝途徑中的轉(zhuǎn)錄本的表達差異進行了初步分析。在此基礎(chǔ)上初步解析了OA生物合成相關(guān)的重要基因，如編碼PKS、硫脂酶、黃素單加氧酶、環(huán)氧化酶、環(huán)氧化物水解酶、細胞色素P450等酶的基因在不同樣品中表達量的差異。
　　綜上，本研究

8、分別篩選出了能與BTX和PLTX高親和力、特異性結(jié)合的適配體，并對其進行優(yōu)化改造，成功制備了基于生物膜干涉技術(shù)的快速檢測BTX的適配體傳感器，獲得了能夠開發(fā)用于PLTX檢測的SPR芯片和適配體識別元件，對于聚醚類毒素檢測提供了新的方法和工具。此外，實現(xiàn)了對利瑪原甲藻P.lima的轉(zhuǎn)錄組解析，并比較了不同營養(yǎng)條件下培養(yǎng)不同時間利瑪原甲藻的基因的表達差異，在此基礎(chǔ)上初步解析了OA生物合成相關(guān)的重要基因的差異表達，對進一步闡明OA的生物合成途