基于核酸適配體的非標(biāo)記熒光檢測(cè)方法研究.pdf

1、核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)篩選得到的一段具有識(shí)別作用的單鏈寡核苷酸片段，可為ssDNA和RNA。核酸適配體能夠通過折疊形成特定的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)與靶標(biāo)高親和力(μmol/L-pmol/L)高特異性結(jié)合。利用適配體技術(shù)開發(fā)的檢測(cè)方法包括比色法、熒光法、電化學(xué)法等多種方法。其中熒光法具有簡(jiǎn)單、快速、易于自動(dòng)化的特點(diǎn)，其有效性已被廣泛證實(shí)。目前已經(jīng)利用適配體開發(fā)了眾多的熒光檢測(cè)方法，但是大部分的熒光法需要對(duì)適配體進(jìn)行

2、修飾，這些操作費(fèi)時(shí)并且分析成本較高，甚至有可能因?yàn)檫m配體上修飾了熒光基團(tuán)或者淬滅基團(tuán)而影響適配體與靶標(biāo)結(jié)合的特性，從而降低檢測(cè)的靈敏度。因此，本研究利用適配體和熒光染料開發(fā)了快速、靈敏、簡(jiǎn)單的非標(biāo)記型熒光法，能夠應(yīng)用于食品中毒素的檢測(cè)，對(duì)于保障食品安全有著重大的意義，主要內(nèi)容包括以下三部分。
　　(1)利用熒光染料PicoGreen能夠嵌入適配體與互補(bǔ)序列形成的dsDNA，從而引起熒光強(qiáng)度改變的特性開發(fā)了一種簡(jiǎn)單的通用型非標(biāo)記熒光

3、法，可高靈敏度高特異性的檢測(cè)無機(jī)離子、蛋白質(zhì)及小分子。通過優(yōu)化PicoGreen染料的用量和檢測(cè)時(shí)間，該方法對(duì)鉀離子檢測(cè)的檢測(cè)限達(dá)到1μmol/L，線性范圍為1μmol/L-1 mol/L;在10mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L的鈉離子存在的條件下，1μmol/L-1 mol/L線性范圍仍然能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)鉀離子的檢測(cè);該方法與原子吸收光譜法分別對(duì)尿樣中鉀離子含量進(jìn)行檢測(cè)，用熒光法測(cè)得的鉀離子的濃度平均是原子吸收光譜法

4、測(cè)得的鉀離子濃度的87±6％。對(duì)凝血酶檢測(cè)限為10U、線性范圍10-1000 U;將1 mg/mL的牛血清白蛋白分別添加到不同濃度的凝血酶溶液中進(jìn)行試驗(yàn)，凝血酶濃度與F/F0之間仍然具有非常好的相關(guān)性(r=-0.9805)。對(duì)腺苷檢測(cè)限達(dá)到0.5μmol/L，線性范圍0.5μmol/L-5mmol/L;在稀釋20倍的胎牛血清樣品中檢測(cè)腺苷，檢測(cè)限為0.5μmol/L，線性范圍0.5μmol/L-5 mmol/L。
　　(2)利用構(gòu)

5、建的基于適配體和PicoGreen染料的非標(biāo)記熒光法對(duì)赭曲霉毒素A(OTA)進(jìn)行檢測(cè)，在優(yōu)化好的條件下，OTA檢測(cè)限達(dá)到1 ng/mL，線性范圍1ng/mL-100μg/mL，特異性檢測(cè)中，分別用非特異性靶標(biāo)玉米赤霉烯酮、N-乙?；?L-苯丙氨酸以及無關(guān)適配體（氯霉素適配體）進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果顯示熒光強(qiáng)度并無明顯變化，證明該方法對(duì)于OTA的檢測(cè)具有非常高的特異性;并且將檢測(cè)方法應(yīng)用于緩沖液稀釋為1％的啤酒當(dāng)中，能夠檢測(cè)到低至1 ng/mL的

6、OTA，線性范圍1 ng/mL-100μg/mL。
　　(3)利用1，3，8，10-四氫-N，N，N，N'，N'，N'-六甲基-1，3，8，10-四氧代-蒽[2，1，9-def:6，5，10-d'e'f]二異喹啉-2，9-二丙胺二碘化物(PTCDI)染料建立了凝血酶非標(biāo)記熒光法檢測(cè)法。設(shè)置PTCDI染料的濃度分別為5nmol/L，50 nmol/L，500 nmol/L，1μmol/L，2μmol/L，5μmol/L，10μmol

7、/L進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置5μmol/L的適配體體積為5μL、10μL、15μL、20μL進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明，在PTCDI染料濃度為500 nmol/L，凝血酶適配體（5μmol/L）20μL的條件下對(duì)凝血酶進(jìn)行檢測(cè)最佳。檢測(cè)限達(dá)到40 pmol/L，線性范圍40-1600 pmol/L;特異性檢測(cè)中，相同濃度的牛血清白蛋白，溶菌酶，小鼠免疫球蛋白G代替凝血酶進(jìn)行試驗(yàn)，均不會(huì)引起熒光強(qiáng)度明顯的變化，充分證明該方法對(duì)于凝血酶的檢測(cè)具有非常高的特異