基于DNA鏈轉(zhuǎn)換反應(yīng)的新型核酸適配體熒光探針的構(gòu)建及應(yīng)用研究.pdf

1、熒光探針具有靈敏度高、設(shè)計(jì)多樣化和定量分析能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是分析化學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。隨著研究工作和熒光技術(shù)的不斷進(jìn)步，熒光探針有著越來越廣闊的發(fā)展前景，在疾病診斷、藥物篩選、臨床毒理學(xué)和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域有著較強(qiáng)的應(yīng)用潛能。核酸適配體是單鏈的寡聚DNA或RNA，通過體外篩選得到，能選擇性的與目標(biāo)結(jié)合，是熒光探針中識(shí)別單元的理想選擇之一。與抗體相比較，核酸適配體具有兩個(gè)顯著的優(yōu)勢:第一，核酸適配體可以通過儀器在體外自動(dòng)化高精度合成，批次差異小，

2、且能夠穩(wěn)定地保存?zhèn)溆?。第二，核酸的結(jié)構(gòu)靈活多變，能與多種信號(hào)放大策略聯(lián)用，以實(shí)現(xiàn)高靈敏度的定量分析，并能用于多種目標(biāo)的測定，包括金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)和細(xì)胞等?；诤怂徇m配體的優(yōu)良性能，核酸適配體熒光探針的設(shè)計(jì)成為近年來生化分析中研究熱點(diǎn)之一。然而，目前核酸適配體熒光探針仍有許多問題需要解決:1）復(fù)雜生物樣品中高靈敏生化分析;2)核酸熒光開關(guān)的生物兼容性;3）熒光成像信號(hào)的不可控性;4）細(xì)胞內(nèi)熒光成像的困難等。
　　支點(diǎn)介導(dǎo)的D

3、NA鏈置換是指兩條互補(bǔ)的DNA以支點(diǎn)為起點(diǎn)和推動(dòng)力，通過步進(jìn)的方式雜交并將另一條互補(bǔ)DNA序列置換下去的過程。該策略在動(dòng)態(tài)DNA納米技術(shù)中得到了廣泛應(yīng)用，能構(gòu)建多種DNA分子器件，包括分子機(jī)器和分子邏輯門等。這種鏈置換誘導(dǎo)的分子重構(gòu)過程與核酸適配體熒光探針的設(shè)計(jì)策略具有相似性，有望成為探針設(shè)計(jì)中一種新型的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式。更為重要的是，這種支點(diǎn)介導(dǎo)的DNA鏈置換可以用于構(gòu)建一些信號(hào)放大策略，且這些策略不需要使用蛋白酶，可以設(shè)計(jì)出低成本和高穩(wěn)

4、定性的熒光探針。其中，雜交鏈反應(yīng)放大和發(fā)夾催化組裝是其中的典型代表，它們在多種核酸適配體探針的設(shè)計(jì)中得到了應(yīng)用。本論文利用支點(diǎn)介導(dǎo)的DNA鏈置換的上述優(yōu)點(diǎn)，將其作為新型的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式或信號(hào)放大策略，用于幾種核酸適配體熒光探針的設(shè)計(jì)，希望有助于解決核酸適配體熒光探針在生化分析領(lǐng)域的一些問題。此外，由于無機(jī)納米材料具有比表面積大、光吸收效率高等特點(diǎn)，本論文還將利用金納米顆粒和硫化鉬納米片的這些優(yōu)點(diǎn)構(gòu)建熒光探針或比色探針，并用于細(xì)胞成像或分析

5、測定的研究。具體內(nèi)容如下:
　　(1)基于核酸適配體的熒光各向異性分析方法引起了人們廣泛關(guān)注。但是，該方法不能直接用于小分子的測定，因?yàn)樾》肿优c適配體結(jié)合后，所引起的分子量的改變太小，而不足以引起熒光各向異性值的顯著變化。本章研究工作提出了一種基于DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合納米線的策略，用于小分子的高靈敏測定。在該分析方法中，小分子與適配體結(jié)合后，與適配體序列部分互補(bǔ)的DNA會(huì)誘發(fā)雜交鏈反應(yīng)放大，進(jìn)而組裝鏈酶親和素，使其與熒光基團(tuán)靠近。以

6、三磷酸腺苷(ATP)為模型小分子，這一策略的檢測下限達(dá)到100nM，比單獨(dú)的雜交鏈反應(yīng)放大或鏈酶親和素放大策略有顯著改進(jìn)。與之前的去組裝方法相比較，本章研究工作所采用的組裝策略不易被干擾物質(zhì)所觸發(fā)，可以降低假陽性幾率進(jìn)而提高分析結(jié)果的可信度。由于熒光各向異性分析方法不依賴于熒光強(qiáng)度變化，它還可以直接用于復(fù)雜生物樣品中ATP的測定，在細(xì)胞培養(yǎng)基、血清及尿液中的可測定的濃度為0.5μM.（第2章）
　　(2)支點(diǎn)介導(dǎo)的DNA鏈置換有著

7、許多獨(dú)特的性質(zhì)，在DNA分子開關(guān)設(shè)計(jì)中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，目前所設(shè)計(jì)的DNA分子開關(guān)有一些缺點(diǎn)，例如它們是由許多獨(dú)立的DNA片段組合而成，它們也不能直接內(nèi)吞到細(xì)胞內(nèi)，這些不利于它們在生物體系中的應(yīng)用。在本章研究中，我們將層狀的DNA雙鏈結(jié)構(gòu)組裝到了納米金表面，設(shè)計(jì)了多種DNA熒光開關(guān)。這些分子開關(guān)可以形成多種邏輯關(guān)系，它們響應(yīng)的信號(hào)變化明顯，且互不干擾。此外，這種層狀的DNA分子開關(guān)可以用于調(diào)節(jié)納米金的尺寸，還可以用于多信號(hào)方式的多

8、目標(biāo)檢測。更為重要的是，納米金可以有效地將DNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)，不需要傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染試劑的輔助，降低了它們對(duì)細(xì)胞的毒性。因此，這種層狀的DNA分子開關(guān)的設(shè)計(jì)將有利于DNA開關(guān)在生物體系中的應(yīng)用，也將有助于DNA納米技術(shù)的發(fā)展。（第3章）
　　(3)核酸適配體是細(xì)胞成像探針中識(shí)別單元的理想選擇之一。但是，目前核酸適配體成像探針大多是采用不可調(diào)控型的設(shè)計(jì):熒光探針與細(xì)胞的目標(biāo)靶蛋白結(jié)合后，它們的熒光信號(hào)一般不可以更改。這種不可調(diào)控的性質(zhì)對(duì)多種

9、目標(biāo)蛋白的同時(shí)成像是不利的，因?yàn)槿菀桩a(chǎn)生光譜重疊;對(duì)于時(shí)空分辨的成像也是不利的，例如研究細(xì)胞內(nèi)吞的過程。為了克服上述缺點(diǎn)，我們設(shè)計(jì)了一類新型的可編碼核酸適配體熒光探針，用于細(xì)胞膜表面膜蛋白的成像研究。這類探針主要是基于鏈置換的動(dòng)態(tài)DNA分子開關(guān)來設(shè)計(jì)的，它們可以用于邏輯控制的成像和可逆熒光標(biāo)記等。在實(shí)驗(yàn)中，我們采用共聚焦成像和流式細(xì)胞術(shù)研究了熒光探針的響應(yīng)情況，證實(shí)了它們可以實(shí)現(xiàn)上述目的。該探針采用了雙重?zé)晒鈽?biāo)記的內(nèi)標(biāo)型設(shè)計(jì)，它可以避免

10、探針濃度的變化和熒光漂白等原因引起的實(shí)驗(yàn)誤差，還可以充分地利用兩種熒光染料各自的優(yōu)點(diǎn)，為細(xì)胞成像研究提供多樣化的選擇。（第4章）
　　(4)硫化鉬形貌與石墨烯類似，且有著許多相似的性質(zhì)，引起了研究人員的廣泛關(guān)注，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域都有著較好的應(yīng)用前景。目前硫化鉬的研究大多集中在物理器件方面的應(yīng)用，在生物醫(yī)學(xué)中特別是與核酸適配體相結(jié)合領(lǐng)域的研究較少。在本章研究工作中，我們設(shè)計(jì)了一種基于硫化鉬納米片的藥物運(yùn)載體系:核酸適配體通過共價(jià)鍵與

11、硫化鉬結(jié)合，作為靶向識(shí)別基團(tuán)，并標(biāo)記熒光素作為細(xì)胞成像的熒光信號(hào);而硫化鉬則作為分子藥物阿霉素和二氫卟酚的吸附材料。通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦成像的結(jié)果可以看出，核酸適配體與硫化鉬結(jié)合后仍然能成功地靶向結(jié)合特定癌細(xì)胞。此外，由于硫化鉬有著較大的比表面積，能夠通過范德華作用吸附大量的的分子藥物。通過體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以看出，該載藥體系可以將藥物分子有效地運(yùn)載到細(xì)胞內(nèi)并殺死癌細(xì)胞，從而證實(shí)了硫化鉬在癌癥治療方面的應(yīng)用潛能。（第5章）

12、>　　(5)納米金比色分析方法有許多優(yōu)點(diǎn)，在分析化學(xué)中得到了廣泛應(yīng)用，檢測目標(biāo)包括核酸和金屬離子等。但是，納米金的比色分析方法還沒有用于金離子的測定，因?yàn)榻痣x子沒有合適的雙齒配體。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，金離子可以將巰基化合物氧化成二硫鍵的產(chǎn)物，顯著改變巰基化合物的結(jié)構(gòu)。基于金離子這一獨(dú)特的性質(zhì)，我們報(bào)道了一種新型的納米金比色分析法，用于金離子的無標(biāo)記定量測定。在該分析方法中，含氟表面活性劑修飾的納米金作為比色法的信號(hào)基團(tuán)，在半胱氨酸作用下會(huì)發(fā)生團(tuán)