基于DNA鏈轉換反應的新型核酸適配體熒光探針的構建及應用研究.pdf

1、熒光探針具有靈敏度高、設計多樣化和定量分析能力強等特點，是分析化學的研究熱點之一。隨著研究工作和熒光技術的不斷進步，熒光探針有著越來越廣闊的發(fā)展前景，在疾病診斷、藥物篩選、臨床毒理學和環(huán)境監(jiān)測等領域有著較強的應用潛能。核酸適配體是單鏈的寡聚DNA或RNA，通過體外篩選得到，能選擇性的與目標結合，是熒光探針中識別單元的理想選擇之一。與抗體相比較，核酸適配體具有兩個顯著的優(yōu)勢:第一，核酸適配體可以通過儀器在體外自動化高精度合成，批次差異小，

2、且能夠穩(wěn)定地保存?zhèn)溆?。第二，核酸的結構靈活多變，能與多種信號放大策略聯(lián)用，以實現(xiàn)高靈敏度的定量分析，并能用于多種目標的測定，包括金屬離子、小分子、蛋白質(zhì)和細胞等?；诤怂徇m配體的優(yōu)良性能，核酸適配體熒光探針的設計成為近年來生化分析中研究熱點之一。然而，目前核酸適配體熒光探針仍有許多問題需要解決:1）復雜生物樣品中高靈敏生化分析;2)核酸熒光開關的生物兼容性;3）熒光成像信號的不可控性;4）細胞內(nèi)熒光成像的困難等。
　　支點介導的D

3、NA鏈置換是指兩條互補的DNA以支點為起點和推動力，通過步進的方式雜交并將另一條互補DNA序列置換下去的過程。該策略在動態(tài)DNA納米技術中得到了廣泛應用，能構建多種DNA分子器件，包括分子機器和分子邏輯門等。這種鏈置換誘導的分子重構過程與核酸適配體熒光探針的設計策略具有相似性，有望成為探針設計中一種新型的信號轉換方式。更為重要的是，這種支點介導的DNA鏈置換可以用于構建一些信號放大策略，且這些策略不需要使用蛋白酶，可以設計出低成本和高穩(wěn)

4、定性的熒光探針。其中，雜交鏈反應放大和發(fā)夾催化組裝是其中的典型代表，它們在多種核酸適配體探針的設計中得到了應用。本論文利用支點介導的DNA鏈置換的上述優(yōu)點，將其作為新型的信號轉換方式或信號放大策略，用于幾種核酸適配體熒光探針的設計，希望有助于解決核酸適配體熒光探針在生化分析領域的一些問題。此外，由于無機納米材料具有比表面積大、光吸收效率高等特點，本論文還將利用金納米顆粒和硫化鉬納米片的這些優(yōu)點構建熒光探針或比色探針，并用于細胞成像或分析

5、測定的研究。具體內(nèi)容如下:
　　(1)基于核酸適配體的熒光各向異性分析方法引起了人們廣泛關注。但是，該方法不能直接用于小分子的測定，因為小分子與適配體結合后，所引起的分子量的改變太小，而不足以引起熒光各向異性值的顯著變化。本章研究工作提出了一種基于DNA-蛋白質(zhì)復合納米線的策略，用于小分子的高靈敏測定。在該分析方法中，小分子與適配體結合后，與適配體序列部分互補的DNA會誘發(fā)雜交鏈反應放大，進而組裝鏈酶親和素，使其與熒光基團靠近。以

6、三磷酸腺苷(ATP)為模型小分子，這一策略的檢測下限達到100nM，比單獨的雜交鏈反應放大或鏈酶親和素放大策略有顯著改進。與之前的去組裝方法相比較，本章研究工作所采用的組裝策略不易被干擾物質(zhì)所觸發(fā)，可以降低假陽性幾率進而提高分析結果的可信度。由于熒光各向異性分析方法不依賴于熒光強度變化，它還可以直接用于復雜生物樣品中ATP的測定，在細胞培養(yǎng)基、血清及尿液中的可測定的濃度為0.5μM.（第2章）
　　(2)支點介導的DNA鏈置換有著

7、許多獨特的性質(zhì)，在DNA分子開關設計中得到了廣泛的應用。但是，目前所設計的DNA分子開關有一些缺點，例如它們是由許多獨立的DNA片段組合而成，它們也不能直接內(nèi)吞到細胞內(nèi)，這些不利于它們在生物體系中的應用。在本章研究中，我們將層狀的DNA雙鏈結構組裝到了納米金表面，設計了多種DNA熒光開關。這些分子開關可以形成多種邏輯關系，它們響應的信號變化明顯，且互不干擾。此外，這種層狀的DNA分子開關可以用于調(diào)節(jié)納米金的尺寸，還可以用于多信號方式的多

8、目標檢測。更為重要的是，納米金可以有效地將DNA運輸?shù)郊毎麅?nèi)，不需要傳統(tǒng)轉染試劑的輔助，降低了它們對細胞的毒性。因此，這種層狀的DNA分子開關的設計將有利于DNA開關在生物體系中的應用，也將有助于DNA納米技術的發(fā)展。（第3章）
　　(3)核酸適配體是細胞成像探針中識別單元的理想選擇之一。但是，目前核酸適配體成像探針大多是采用不可調(diào)控型的設計:熒光探針與細胞的目標靶蛋白結合后，它們的熒光信號一般不可以更改。這種不可調(diào)控的性質(zhì)對多種

9、目標蛋白的同時成像是不利的，因為容易產(chǎn)生光譜重疊;對于時空分辨的成像也是不利的，例如研究細胞內(nèi)吞的過程。為了克服上述缺點，我們設計了一類新型的可編碼核酸適配體熒光探針，用于細胞膜表面膜蛋白的成像研究。這類探針主要是基于鏈置換的動態(tài)DNA分子開關來設計的，它們可以用于邏輯控制的成像和可逆熒光標記等。在實驗中，我們采用共聚焦成像和流式細胞術研究了熒光探針的響應情況，證實了它們可以實現(xiàn)上述目的。該探針采用了雙重熒光標記的內(nèi)標型設計，它可以避免

10、探針濃度的變化和熒光漂白等原因引起的實驗誤差，還可以充分地利用兩種熒光染料各自的優(yōu)點，為細胞成像研究提供多樣化的選擇。（第4章）
　　(4)硫化鉬形貌與石墨烯類似，且有著許多相似的性質(zhì)，引起了研究人員的廣泛關注，在生物醫(yī)學等領域都有著較好的應用前景。目前硫化鉬的研究大多集中在物理器件方面的應用，在生物醫(yī)學中特別是與核酸適配體相結合領域的研究較少。在本章研究工作中，我們設計了一種基于硫化鉬納米片的藥物運載體系:核酸適配體通過共價鍵與

11、硫化鉬結合，作為靶向識別基團，并標記熒光素作為細胞成像的熒光信號;而硫化鉬則作為分子藥物阿霉素和二氫卟酚的吸附材料。通過流式細胞術和共聚焦成像的結果可以看出，核酸適配體與硫化鉬結合后仍然能成功地靶向結合特定癌細胞。此外，由于硫化鉬有著較大的比表面積，能夠通過范德華作用吸附大量的的分子藥物。通過體外細胞毒性實驗的數(shù)據(jù)可以看出，該載藥體系可以將藥物分子有效地運載到細胞內(nèi)并殺死癌細胞，從而證實了硫化鉬在癌癥治療方面的應用潛能。（第5章）

12、>　　(5)納米金比色分析方法有許多優(yōu)點，在分析化學中得到了廣泛應用，檢測目標包括核酸和金屬離子等。但是，納米金的比色分析方法還沒有用于金離子的測定，因為金離子沒有合適的雙齒配體。據(jù)文獻報道，金離子可以將巰基化合物氧化成二硫鍵的產(chǎn)物，顯著改變巰基化合物的結構。基于金離子這一獨特的性質(zhì)，我們報道了一種新型的納米金比色分析法，用于金離子的無標記定量測定。在該分析方法中，含氟表面活性劑修飾的納米金作為比色法的信號基團，在半胱氨酸作用下會發(fā)生團