基于免固定靶標(biāo)法的C反應(yīng)蛋白核酸適配體篩選的研究.pdf

1、C反應(yīng)蛋白（C-reactiveprotein，CRP)是由肝臟生成的一種急性期蛋白，是炎癥及心血管疾病重要的指示因子與危險(xiǎn)因子。目前廣泛應(yīng)用的CRP檢測(cè)方法多是基于抗體輔助的。與抗體相比，核酸適配體不僅具有類似抗體的高親和力和高特異性，還具有分子量小、易合成和修飾、毒性小、穩(wěn)定性好等優(yōu)勢(shì)。因此，有研究者正嘗試篩選CRP的核酸適配體及構(gòu)建基于核酸適配體的CRP檢測(cè)傳感器，但基于篩選出的CRP核酸適配體實(shí)現(xiàn)CRP的檢測(cè)則鮮有報(bào)道。

2、　　傳統(tǒng)的核酸適配體篩選方法多是通過(guò)將靶標(biāo)或文庫(kù)固定在某種固相基質(zhì)上進(jìn)行篩選，并利用固相基質(zhì)分離結(jié)合靶標(biāo)的鏈與未結(jié)合的鏈。然而，固定靶標(biāo)可能會(huì)對(duì)其構(gòu)象產(chǎn)生影響，而固定文庫(kù)則可能會(huì)增加空間位阻從而影響靶標(biāo)與文庫(kù)的結(jié)合。已報(bào)道的三條CRP核酸適配體，都是通過(guò)將CRP固定在微珠、磁珠及微孔板表面上進(jìn)行篩選的。但是有研究表明，固定CRP會(huì)引起其構(gòu)象的變化，使得CRP容易轉(zhuǎn)變成單獨(dú)的亞單元結(jié)構(gòu);并且其中一條RNA核酸適配體與一條DNA核酸適配體只

3、與CRP的亞單元結(jié)合，而不與CRP五聚體結(jié)合。因此，有必要利用免固定靶標(biāo)的篩選方法獲取CRP的核酸適配體，以便為相關(guān)分析應(yīng)用提供性能優(yōu)良的探針。
　　然而，已發(fā)展的一些免固定的篩選方法，如膜過(guò)濾、毛細(xì)管電泳等，仍然存在一些問(wèn)題。膜過(guò)濾法往往會(huì)造成較強(qiáng)的非特異性吸附，且只適用于分子量較大的靶標(biāo);而毛細(xì)管電泳法則需要專門的儀器。由于氧化石墨烯(GrapheneOxide，GO)對(duì)單鏈DNA(ssDNA)有較強(qiáng)的吸附能力，而對(duì)雙鏈DNA

4、(dsDNA)或結(jié)合了靶標(biāo)的核酸適配體的吸附能力則較弱，因此GO被用于篩選過(guò)程以分離結(jié)合靶標(biāo)的鏈與未結(jié)合的鏈，進(jìn)而發(fā)展出一種GO輔助的免固定篩選法(GO-SELEX)，克服了膜過(guò)濾法及毛細(xì)管電泳法所存在的問(wèn)題。
　　本論文為解決以上的問(wèn)題及進(jìn)一步提高篩選出的核酸適配體的親和力，采用改進(jìn)的GO-SELEX，以人CRP為靶標(biāo)開展了核酸適配體的篩選工作，并對(duì)篩選出的核酸適配體的性質(zhì)進(jìn)行了考察。研究?jī)?nèi)容包括:
　　(1)改進(jìn)氧化石墨

5、烯輔助的免固定靶標(biāo)的篩選方法，并用于CRP核酸適配體的篩選
　　為了避免固定CRP可能造成的構(gòu)象變化及提高核酸適配體的親和力，改進(jìn)了免固定靶標(biāo)的GO-SELEX篩選方法。首先將文庫(kù)與GO溶液孵育，通過(guò)GO與ssDNA之間的π-π堆積作用將文庫(kù)吸附在GO上，再加入CRP溶液孵育，與CRP結(jié)合較強(qiáng)的DNA鏈因形成了CRP-DNA復(fù)合物而從GO上解吸附下來(lái)，而結(jié)合較弱或不結(jié)合的DNA鏈仍然吸附在GO上，通過(guò)離心收集結(jié)合了CRP的DNA鏈

6、。隨著篩選輪數(shù)的增加，加入以牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)及肌紅蛋白為對(duì)照蛋白的反篩選過(guò)程，同時(shí)文庫(kù)與CRP的投入比例也逐漸減少。這樣的改進(jìn)使得與CRP結(jié)合較弱的DNA鏈因預(yù)先被吸附在GO上而很難形成CRP-DNA復(fù)合物，從而提高了篩選出的核酸適配體的親和力。經(jīng)過(guò)十輪的篩選，對(duì)富集度較高的第七輪文庫(kù)進(jìn)行了高通量測(cè)序，經(jīng)初步分析后獲得20條候選序列。
　　(2)CRP核酸適配體的序列優(yōu)化及性質(zhì)考察
　　通過(guò)分析

7、比對(duì)20條候選序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，選取了其中九條序列，利用固定蛋白的表面等離子體共振(Surfaceplasmonresonance，SPR)分析方法對(duì)其進(jìn)行親和力的考察，獲得了四條與CRP親和力較好的核酸適配體CRP-80-2、CRP-80-5、CRP-80-13和CRP-80-17，其解離常數(shù)分別為1.3μM、24.8nM、40.7nM和3.9nM。對(duì)其中親和力最好的CRP-80-17進(jìn)行序列優(yōu)化，通過(guò)裁掉其兩端的固定序列，獲得了一條只