單點(diǎn)突變蛋白特異的RNA適配體篩選及功能研究.pdf

1、p53蛋白，也被認(rèn)為是腫瘤的抑制蛋白。自從發(fā)現(xiàn)以來(lái)，被證實(shí)參與細(xì)胞周期調(diào)控，激活DNA修復(fù)、維持基因組穩(wěn)定及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。在超過(guò)50％的人類的癌癥中都出現(xiàn)p53功能缺失，其中就包括單位點(diǎn)和多位點(diǎn)的突變及結(jié)構(gòu)的扭曲。同樣也有越來(lái)越多的研究證實(shí)，p53蛋白的突變，使得其空間構(gòu)象發(fā)生變化，從而失去對(duì)細(xì)胞周期調(diào)控與促進(jìn)細(xì)胞凋亡的重要生物學(xué)功能，與此同時(shí)，還會(huì)得到新的功能(Gain-of-Function，GOF)，如促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移、侵染等，由抑癌

2、基因變?yōu)榘┗?。目前越?lái)越多的研究組開(kāi)始關(guān)注p53蛋白突變體的研究，其中就包括促進(jìn)突變體的回復(fù)突變及抑制其生物學(xué)功能。此項(xiàng)研究對(duì)于癌癥的靶點(diǎn)治療具有重要的生物學(xué)研究與醫(yī)學(xué)價(jià)值。
　　核酸適配體(aptamer)是一段短的單鏈核酸分子，其特點(diǎn)是能夠根據(jù)結(jié)構(gòu)特異性針對(duì)性地地結(jié)合多種靶標(biāo)分子，如蛋白質(zhì)、小分子、糖、脂肪等。它是由一個(gè)叫 SELEX(Systematic Evolution of Ligand Exponentialenr

3、ichment)的體外篩選進(jìn)程得到的。SELEX技術(shù)自從1990年由三個(gè)研究組同時(shí)發(fā)明并已廣泛地運(yùn)用到諸如核糖體開(kāi)關(guān)、靶向治療等生物及醫(yī)學(xué)應(yīng)用。于是我們有理由相信，通過(guò)此篩選方法，我們也可以篩選到對(duì)諸如p53突變體有高親和力和特異性的核酸適配體。
　　目前，還未見(jiàn)研究組篩選到p53突變體適配體的報(bào)導(dǎo)。在本論文中，我們的首要研究目的就是能夠篩選到p53R175H的適配體。由于此突變型與野生型的唯一區(qū)別只在于第175位的氨基酸突變，所

4、以我們對(duì)傳統(tǒng)的SELEX篩選過(guò)程進(jìn)行了改進(jìn)，名為差別競(jìng)爭(zhēng)SELEX篩選，將p53野生型與突變型蛋白質(zhì)分別經(jīng)過(guò)固相偶聯(lián)，同時(shí)投入體系中，競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合庫(kù)分子，最大限度地增加篩選特異性與差異性。經(jīng)過(guò)5輪的差別競(jìng)爭(zhēng)SELEX篩選，我們得到了21個(gè)p53R175H蛋白的候選適配體。通過(guò)親和力檢測(cè)，適配體p53R175H-APT與p53R175H蛋白的親和力大大超過(guò)對(duì)于野生型p53的親和力，并且在凝膠遷移實(shí)驗(yàn)中我們最終確定p53R175H-APT能

5、夠在體外和p53R175結(jié)合。所以我們最終確定的p53R175H-APT作為我們后續(xù)研究的對(duì)象。
　　盡管在親和力檢測(cè)中，p53R175H-APT對(duì)于p53突變體有著相對(duì)于野生型p53較強(qiáng)的親和力，但其細(xì)胞學(xué)效應(yīng)還有待研究。在本論文中，我們?cè)噲D闡述篩選到的適配體p53R175H-APT在細(xì)胞中的功能。首先，我們必須確定p53R175H-APT在其靶標(biāo)的選擇上具有嚴(yán)格的特異性。在含有p53野生型的HEK293T和HeLa細(xì)胞中，通過(guò)

6、將p53R175H-APT轉(zhuǎn)染入上述兩種細(xì)胞中，無(wú)論從表型還是從細(xì)胞生長(zhǎng)于凋亡的情況看，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組有顯著性差異。同時(shí)，在只含有p53的另一個(gè)突變體p53R273H的H1299細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染p53R175H-APT，相對(duì)于對(duì)照組我們依然沒(méi)有觀察到明顯的差別。在完成了以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)p53R175H-APT對(duì)于含有p53野生型與p53其他突變體的細(xì)胞沒(méi)有顯著性作用之后，我們將此適配體構(gòu)建到質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染入H1299-p53R175H穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)

7、胞系中，我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)p53R175H-APT處理的細(xì)胞，細(xì)胞增殖得到明顯的抑制，細(xì)胞的死亡明顯增多。而對(duì)于含有p53野生型的細(xì)胞，則沒(méi)有此現(xiàn)象。側(cè)面說(shuō)明此RNA適配體可以特異性地識(shí)別p53R175H并顯著影響細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡。為了更加確定產(chǎn)生如此明顯的生物學(xué)差別與p53突變體相關(guān)，我們通過(guò)p53的免疫沉淀證實(shí)了在細(xì)胞中，p53R175H-APT與p53突變體結(jié)合的確大于IgG和scramble序列對(duì)p53突變體的結(jié)合能力。與此同時(shí)，

8、通過(guò)克隆形成實(shí)驗(yàn)與softagar實(shí)驗(yàn)我們證明了通過(guò)此適配體處理的細(xì)胞，其惡性程度與生長(zhǎng)能力也有明顯降低。由于很多p53的突變屬于功能獲得型突變，腫瘤細(xì)胞的遷移能力會(huì)不同程度地提高。為此我們?cè)O(shè)計(jì)了Transwell遷移實(shí)驗(yàn)和wound healing實(shí)驗(yàn)，證實(shí)經(jīng)過(guò)此適配體處理過(guò)的細(xì)胞其遷移能力得到明顯降低。進(jìn)一步，在分子水平上，p53R175H-APT處理的細(xì)胞表現(xiàn)出更像p53野生型的調(diào)控方式，多個(gè)p53相互作用基因均有激活，一定程度上

9、說(shuō)明此適配體可使p53突變體的功能回復(fù)。同時(shí)，我們通過(guò)免疫熒光更加直觀地證明了，經(jīng)過(guò)p53R175H-APT處理過(guò)的p53突變體，能夠從構(gòu)象上使其回復(fù)成p53野生型。
　　為了從更高水平驗(yàn)證此效應(yīng)可以運(yùn)用到實(shí)體瘤的治療中，我們建立了裸鼠腫瘤模型，并將適配體通過(guò)實(shí)體瘤注射與靜脈注射兩種方法進(jìn)行治療。相對(duì)于對(duì)照組，適配體組的裸鼠腫瘤明顯減小并維持較低水平，甚至消失。通過(guò)對(duì)實(shí)體瘤切片的TUNEL凋亡檢測(cè)染色，我們發(fā)現(xiàn)在適配體治療組中的凋

10、亡細(xì)胞明顯多于對(duì)照組。更加證實(shí)了p53R175H-APT可以通過(guò)p53R175H作用于腫瘤細(xì)胞，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡、降低細(xì)胞生長(zhǎng)能力、限制腫瘤細(xì)胞的遷移及具有一定程度的臨床潛力。
　　綜上所述，本論文的研究成果闡述了一個(gè)新的SELEX篩選方法，并通過(guò)此方法成功篩選出與野生型p53只有一個(gè)堿基差異的p53R175H的適配體p53R175H-APT。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其可以抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了其潛在的臨床價(jià)值，